膀胱癌復(fù)發(fā)與多基因位點(diǎn)關(guān)聯(lián)性的研究.pdf

1、膀胱癌是一種常見的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率。目前已有少數(shù)使用全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)篩選膀胱癌發(fā)病相關(guān)基因的報(bào)道，而尚未見通過該方法篩選膀胱復(fù)發(fā)相關(guān)基因的報(bào)道。本課題通過“膀胱癌發(fā)病相關(guān)基因的驗(yàn)證”和“膀胱癌復(fù)發(fā)相關(guān)基因位點(diǎn)的篩選”兩個(gè)部分的研究，驗(yàn)證了部分已被報(bào)道的膀胱癌發(fā)病相關(guān)位點(diǎn)，并篩選出了部分膀胱癌復(fù)發(fā)相關(guān)位點(diǎn)，同時(shí)明確了GWAS作為膀胱癌復(fù)發(fā)相關(guān)基因篩選方式的可行性。
　　 第一部分膀胱癌發(fā)病相關(guān)基因的驗(yàn)

2、證
　　 目的：通過以全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)為核心的分子遺傳學(xué)手段，結(jié)合臨床資料的總結(jié)與分析，在中國人群中驗(yàn)證部分已經(jīng)被報(bào)道的可能與膀胱癌發(fā)病有關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，同時(shí)探討在中國人群中使用該方法研究不同組別人群間基因差異的可行性。
　　 材料和方法：自2010年起于復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院泌尿外科招募膀胱癌患者共164名(均經(jīng)病理學(xué)檢驗(yàn)證實(shí)為尿路上皮癌)，在告知患者實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、征得患者同意并簽署知情同意書?/p>

3、情況下，采取每名患者靜脈血5ml，另外選取1008名經(jīng)確認(rèn)未罹患腫瘤的健康對(duì)照志愿者，同樣在簽訂知情同意書之后，每人抽取5ml靜脈血。選取目前已經(jīng)被報(bào)道過的16個(gè)可能與膀胱癌發(fā)病有關(guān)的SNPs作為重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象。膀胱癌患者及健康對(duì)照志愿者提供的5ml靜脈血置入乙二胺四乙酸二鉀(EDTA)抗凝管中，立刻混勻，離心，吸除血清，獲得血細(xì)胞，提取外周血樣本總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA的并純化，合成cRNA，純化、標(biāo)記并片段化，行芯片雜交，最終進(jìn)行

4、芯片掃描。對(duì)上述患者進(jìn)行詳細(xì)的臨床資料總結(jié)，包括姓名、性別、年齡、吸煙史、初次確診日期、術(shù)中所見、術(shù)后病理結(jié)果。對(duì)健康對(duì)照志愿者，同樣登記姓名、性別、年齡、吸煙史等資料，并將之與患者的資料進(jìn)行對(duì)比。使用PLINK軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，行Fisher確切概率法檢驗(yàn)，根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果，對(duì)上述SNPs基因型的分布進(jìn)行Hardy-Weinberg(HWE)平衡檢驗(yàn)。同時(shí)應(yīng)用Logistic回歸模型，校正年齡、吸煙史等因素，計(jì)算比值比(OR)和95％

5、置信區(qū)間。
　　 結(jié)果：通過對(duì)患者組及對(duì)照組臨床資料的分析，我們確定，兩者在性別、年齡、吸煙史等方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過對(duì)膀胱癌患者及健康對(duì)照志愿者在上述16個(gè)SNPs中的比較，我們發(fā)現(xiàn)了2個(gè)在患者組與對(duì)照組之間，等位基因分布存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的SNPs，他們分別是位于4號(hào)染色體短臂1區(qū)6帶，定位于tacc-3基因的第5個(gè)內(nèi)含子中的rs798766(C＞T，p=0.00163)和位于8號(hào)染色體長臂2區(qū)4帶，定位于myc基因上游約的rs

6、9642880(G＞T，p=0.04587)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)具有存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異潛質(zhì)的SNP--定位于psca基因的第1個(gè)外顯子中的rs2294008(C＞T)。
　　 結(jié)論：rs798766、rs9642880以及rs2294008在患者組和對(duì)照組之間表現(xiàn)出了不同程度的等位基因分布差異性，這提示上述SNPs有望成為膀胱癌的基因診斷標(biāo)志。同時(shí)，這一部分的研究證明，通過GWAS技術(shù)在中國人群中，尋找不同組別見部分SNPs等位基因分布的差

7、異是切實(shí)可行的。
　　 第二部分膀胱癌復(fù)發(fā)相關(guān)基因位點(diǎn)的篩選
　　 目的：以上述第一部分的研究結(jié)果作為基礎(chǔ)，通過以GWAS為核心的分子遺傳學(xué)手段，結(jié)合臨床資料的總結(jié)與分析，在中國人群中篩選可能與膀胱癌復(fù)發(fā)有關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)，同時(shí)探討以基因芯片作為核心技術(shù)，在中國人群中篩選膀胱癌復(fù)發(fā)相關(guān)基因位點(diǎn)的可行性。
　　 材料與方法：選取上述164名膀胱癌患者，根據(jù)其膀胱癌復(fù)發(fā)與否，分為復(fù)發(fā)組(40人)和非復(fù)

8、發(fā)組(124人)，將他們提供的5ml靜脈血置入乙二胺四乙酸二鉀(EDTA)抗凝管中，立刻混勻，離心，吸除血清，獲得血細(xì)胞，提取外周血樣本總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA的并純化，合成cRNA，純化、標(biāo)記并片段化，行芯片雜交，最終進(jìn)行芯片掃描。仍然選取目前已經(jīng)被報(bào)道過的16個(gè)可能與膀胱癌發(fā)病有關(guān)的SNPs作為重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象。對(duì)上述患者進(jìn)行詳細(xì)的臨床資料總結(jié)，包括姓名、性別、年齡、吸煙史、初次確診日期、術(shù)中所見(腫瘤數(shù)目、形態(tài)、大小等)、術(shù)后病理

9、結(jié)果、復(fù)發(fā)時(shí)間、復(fù)發(fā)次數(shù)，并將復(fù)發(fā)組與非復(fù)發(fā)組的資料進(jìn)行對(duì)比。使用STATA12.0和PLINK軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，行X2檢驗(yàn)Fisher確切概率法檢驗(yàn)，根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果，對(duì)上述SNPs基因型的分布進(jìn)行Hardy-Weinberg(HWE)平衡檢驗(yàn)。同時(shí)應(yīng)用Logistic回歸模型，校正年齡、吸煙史等因素，計(jì)算比值比(OR)和95％置信區(qū)間。
　　 結(jié)果：通過對(duì)復(fù)發(fā)組和非復(fù)發(fā)組臨床資料的分析，我們確定，兩者在性別、年齡、吸煙史、腫

10、瘤的分期、分級(jí)、手術(shù)方式的選擇等方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過對(duì)復(fù)發(fā)組和非復(fù)發(fā)組在上述16個(gè)SNPs中的比較，在基因型比較中，我們發(fā)現(xiàn)了2個(gè)SNPs的特定基因型對(duì)膀胱癌的復(fù)發(fā)具有保護(hù)作用，它們分別是位于8號(hào)染色體短臂2區(qū)2帶的rs1495741(GG基因型，p=0.013)以及位于19號(hào)染色體長臂1區(qū)3帶的ercc-2基因中的rs13181(GT基因型，p=0.024)；在等位基因分析中，我們發(fā)現(xiàn)位于19號(hào)染色體長臂1區(qū)3帶上的ccne-1基因