脆性位點(diǎn)基因WWOX對膀胱癌抑癌作用的研究.pdf

1、腫瘤的生成是一個復(fù)雜的多步驟的過程,包括癌基因的激活和抑癌基因的失活。大多數(shù)上皮細(xì)胞腫瘤以純合性缺失和包括16號染色體長臂(16q)在內(nèi)的雜合性缺失(LOH)為特征。近年來,人類16號染色體的變異與上皮細(xì)胞惡性腫瘤的關(guān)系受到越來越多的關(guān)注。研究證實(shí),16號染色體雜合子丟失(LOH)等變異頻繁出現(xiàn)在乳腺癌組織中,并且在前列腺癌、肺癌等惡性腫瘤中也有同樣發(fā)現(xiàn)。WWOX基因是新近在16號染色體16q23.3-24.1區(qū)域克隆出的一個基因,大小

2、約1.1mb,跨越整個脆性位點(diǎn)FRA16D。研究表明,WWOX在多種惡性腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)降低或缺如,提示W(wǎng)WOX為抑癌基因?；蚯贸闶笱芯窟€表明,WWOX不但是抑癌基因,并且WWOX的失活即可誘發(fā)腫瘤生成。
　　 膀胱癌是我國臨床上常見的腫瘤之一,是一種直接威脅患者生存的疾病。膀胱癌突出的生物學(xué)特性是其高復(fù)發(fā)性,凡保留膀胱的各種手術(shù)治療,術(shù)后2年內(nèi)超過半數(shù)的病人要復(fù)發(fā),復(fù)發(fā)時約16％-25％惡性程度有增加的趨勢。目前

3、,臨床上對膀胱癌的治療方式主要采用以手術(shù)切除為主,結(jié)合灌注化療、放射治療和免疫治療等的綜合療法有一定的治療作用,但是效果,尤其遠(yuǎn)期療效并不令人滿意。隨著腫瘤分子生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,作為攻克癌癥的主要研究方向之一,基因治療成為一種膀胱癌治療的新手段。目前,在世界范圍內(nèi)已有一百余項(xiàng)基因治療方案獲準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,并取得較好的效果。相對于其他腫瘤,通過尿道可將基因載體直接置于膀胱腫瘤周圍,為膀胱癌的基因治療提供了更好地治療方式。本

4、實(shí)驗(yàn)應(yīng)用體外研究的方法,探討WWOX基因與膀胱腫瘤的關(guān)系,為膀胱移行細(xì)胞癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的：
　　 1、檢測膀胱移行細(xì)胞癌組織標(biāo)本及膀胱癌細(xì)胞株中WWOX蛋白、WWOXMrna的表達(dá),探討其在膀胱移行細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用;
　　 2、采用基因工程技術(shù)構(gòu)建整合有WWOX基因的真核表達(dá)載體,利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法在體外將WWOX基因?qū)肴税螂装┘?xì)胞系T24,并利用Western blot、RT-PCR檢測

5、轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的WWOX表達(dá)情況;
　　 3、多種方法檢測轉(zhuǎn)染W(wǎng)WOX基因后膀胱癌細(xì)胞系增殖和凋亡情況及與化療藥物聯(lián)合作用的關(guān)系。
　　 方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 主要試劑:人膀胱癌T24細(xì)胞株購自中國細(xì)胞典藏中心;兔抗人WWOX多克隆抗體購自Abcom公司;總RNA提取試劑盒購自GIBCOBRL公司;RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司;PCR引物購自TaKaRa公司;DC Protein ass

6、ay試劑盒購自Bio-Rad公司;硝酸纖維素膜(PVDF)購自Millipore公司,pcDNA3.1(+)連接試劑盒購自Promega公司;X-gal、IPTG、真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)購自Invitrogen公司;Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司;阿霉素(ADR)購自Pharmacia公司;碘化丙啶(PI)購自Sigma公司。
　　 主要儀器:溫育箱、切片機(jī)、光學(xué)顯微鏡、

7、高壓鍋、冰箱、顯微照相裝置、紫外/可見光光度計(jì)、低溫超速離心機(jī)、組織勻漿機(jī)、超聲粉碎機(jī)、轉(zhuǎn)印儀、搖床、電泳儀、自動電泳凝膠成像分析儀、-70℃深凍冰箱、流式細(xì)胞儀、烤片機(jī)、熒光倒置顯微鏡等。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、研究膀胱移行細(xì)胞癌組織及膀胱癌細(xì)胞株中WWOX的表達(dá)情況
　　 通過免疫組化、RT-PCR、Western blot方法,研究在膀胱移行細(xì)胞癌組織標(biāo)本及膀胱癌細(xì)胞株T24中WWOX的表達(dá)情況。免

8、疫組化的WWOX抗體工作濃度為1:200;Western blot方法WWOX抗體稀釋比例為1:100003 RT-PCR的引物為:
　　 WWOX引物序列為:
　　 上游:5’-TGCTCCTTGCTGCATTGAT-3’
　　 下游:5’-TGCGTATTCTACTCCCTCTGG3’
　　 擴(kuò)增片段大小為149bp。
　　 內(nèi)參照物為B-actin,序列為:
　　 上游:5’-TCA

9、 CCT TCA CCG TTC CAG TTT-3’
　　 下游:5’-AGT TGC GTT ACA CCC TTT CTT G-3’
　　 擴(kuò)增片段大小為150bp。
　　 2、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 細(xì)胞置于37℃,飽和濕度,含5％CO2的孵箱中培養(yǎng),培養(yǎng)液為含有10％新生小牛血清的RPMI1640,每2-3天傳代一次,取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3、真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-wwOx的構(gòu)建

10、r>　　 通過RT-PCR方法獲得WWOX全長ORF的目的片段,所得產(chǎn)物全長1245bp。WWOX引物序列為:上游:5’-GCCAGGTGCCTCCACAGTCAGC-3’,下游:5’-TGTGTGTGCCCATCCGCTCT-3’。將目的片段與Pmd-19-T載體進(jìn)行TA克隆后,再轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌,挑選陽性克隆的菌株進(jìn)行DNA測序以確定正確的菌株,常規(guī)搖菌擴(kuò)增后,選取含有正確WWOX Cdna的T載體及pcDNA3.1(+)的陽性菌進(jìn)行

11、質(zhì)粒提取。質(zhì)粒進(jìn)行測序,選擇測序正確的與pcDNA3.1(+)載體進(jìn)行酶切,而后進(jìn)行電泳,膠回收,用酶將回收產(chǎn)物連接為pcDNA3.1(+)-WWOX質(zhì)粒。
　　 4、基因轉(zhuǎn)染
　　 按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染后在含有G-418的培養(yǎng)液中篩選,得到穩(wěn)定表達(dá)WWOX的細(xì)胞株,置于37℃,飽和濕度,含5％CO2的孵箱中培養(yǎng),培養(yǎng)液為含有10％新生小牛血清的RPMI1640。
　

12、　 5、T24/WWOX細(xì)胞株的篩選建立與鑒定
　　 T24細(xì)胞系G-418篩選試驗(yàn)產(chǎn)生陽性克隆,收集后傳代擴(kuò)增,命名為T24/WWOX細(xì)胞株。收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot、RT-PCR檢測WWOX的表達(dá)。
　　 6、克隆形成實(shí)驗(yàn)
　　 于每個培養(yǎng)皿中加入10ml的含有100個細(xì)胞的培養(yǎng)液,使細(xì)胞分散均勻。置于37℃,5％CO2及飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。2 w后培養(yǎng)皿中可見克隆形成,終止培養(yǎng),移

13、除培養(yǎng)液,PBS均勻小心浸洗2次,純甲醇5ml固定15 min,然后移去固定液,加適量Giemsa應(yīng)用染色液染30 min后。在低倍顯微鏡計(jì)數(shù)大于50個細(xì)胞的克隆數(shù)。克隆形成率％=(平均克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100％
　　 7、MTT方法檢測細(xì)胞抑制率
　　 將各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,加入PBS配制的ADR(12.μg/ml),37℃孵育。加入MTT溶液(即終濃度為5 mg/ml),自動酶聯(lián)免疫檢測儀49

14、0nm處測量各孔的吸光值(A)。計(jì)算抑制率=(1——加藥組A490/對照組A490)×100％。
　　 8、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率
　　 取1×106個藥物處理24h的轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液。用PBS洗滌2次,800rpm離心5min,棄上清液,加入冰預(yù)冷的70％酒精1ml重懸,固定過夜后,以800 rpm離心5min去除固定液,PBS3ml重懸細(xì)胞,加入PI染液500μl,染色30min。350目篩網(wǎng)過濾,去除

15、成團(tuán)細(xì)胞。1h內(nèi)FCM檢測細(xì)胞凋亡率。
　　 9、吖啶橙熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡率
　　 各組細(xì)胞分別置37℃、5％CO2及飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。加入12.5μg/ml的ADR,PBS清洗2次,制備單細(xì)胞懸液,制備濃度為1×107個/ml。將5μl吖啶橙染液加入9μl的細(xì)胞懸液中混勻,取20μl混合液于載玻片上,蓋玻片封片后置于熒光顯微鏡下觀察。熒光顯微鏡所用吸收波長405nm,發(fā)射波長570nm。

16、r>　　 10、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,陽性率比較采用x2檢驗(yàn),計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示。組間參數(shù)采用One-way ANOVA或。Two-way ANOVA分析,如有差異,兩兩比較采用q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05,P＜0.05認(rèn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、膀胱移行細(xì)胞癌組織中WWOX表達(dá)的檢測結(jié)果
　　 使用免疫組化、Western blot

17、、RT-PCR方法均檢測到膀胱癌組織中WWOX表達(dá)陽性率顯著低于癌旁正常組織。其中免疫組化顯示W(wǎng)WOX蛋白的陽性表達(dá)率為20.5％(16/78),Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示78例膀胱移行細(xì)胞癌組織中的18例(23.1％)為陽性,RT-PCR方法檢測18例(23.1％)為陽性表達(dá)。膀胱癌組織和癌旁正常組織的陽性率比較,差異具有顯著性意義(P＜0.01)。WWOX表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌的組織學(xué)分級呈負(fù)相關(guān),即癌細(xì)胞分化程度越高WWO

18、X基因表達(dá)率越高。膀胱癌細(xì)胞株T24未見WWOX蛋白表達(dá)。
　　 2、真核表達(dá)載體pcDNa3.1(+)-WWOX的構(gòu)建
　　 真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-WWOX經(jīng)酶切鑒定和基因序列分析證實(shí)序列相同,表明構(gòu)建成功。
　　 3、基因轉(zhuǎn)染及t24/WWOX細(xì)胞株的篩選建立與鑒定
　　 G-418篩選兩周后,空白對照組細(xì)胞全部死亡,轉(zhuǎn)染后的T24/WWOX細(xì)胞組生長良好,形態(tài)規(guī)則,以梭形、多邊形居多。

19、結(jié)果經(jīng)Western Blot驗(yàn)證,證實(shí)存在WWOX蛋白的表達(dá),RT-PCR也證實(shí)轉(zhuǎn)染后膀胱移行上皮細(xì)胞癌細(xì)胞T24中存在WWOX的表達(dá),說明轉(zhuǎn)染成功。
　　 4、克隆形成實(shí)驗(yàn)
　　 與空白對照組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體組相比,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-WWOX組的細(xì)胞克隆形成能力顯著的降低了。T24/WWOX組、T24/neo組與T24組的克隆形成率分別是(22.5±6.5)％、(45.1±3.9)％和(4

20、6.6±5.6)％。T24/WWOX組與T24/neo組和T24組細(xì)胞相比,克隆形成能力明顯降低(P＜0.01);T24/neo組和T24組兩組之間的克隆形成能力沒有顯著差異(P＞0.05)。
　　 5、轉(zhuǎn)染W(wǎng)WOX對ADR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響
　　 經(jīng)濃度12.μg/ml的阿霉素處理后,流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率,結(jié)果顯示,與相應(yīng)各對照組細(xì)胞相比較,阿霉素處理的細(xì)胞凋亡率均明顯增加(P＜0.01),且隨著藥物濃度的增

21、加,各組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率也明顯增加(P＜0.01)。其中T24,/WWOX組的細(xì)胞凋亡率比其他兩組明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。
　　 6、MTT方法檢測
　　 MTT結(jié)果顯示阿霉素對于三組細(xì)胞株均有增值抑制效應(yīng),生長抑制率分別為T24/WWOX組(82.5±3.8)％、T24/neo組(42.5±9.3)％和T24組(43.4±4.7)％,即轉(zhuǎn)染W(wǎng)WOX組的細(xì)胞株比其他兩組的生長抑制率明顯增強(qiáng),差異具有顯著性意義(P＜0.

22、01)。
　　 7、吖啶橙熒光染色結(jié)果
　　 在經(jīng)過阿霉素處理后,熒光顯微鏡下可見三組細(xì)胞株均有細(xì)胞皺縮,呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài),細(xì)胞數(shù)量減少,并且T24/WWOX組的凋亡形態(tài)學(xué)改變更加明顯。
　　 結(jié)論：
　　 1、相對于膀胱正常組織,膀胱移行細(xì)胞癌組織的WWOX表達(dá)率明顯降低,兩組間的差距有顯著意義;
　　 2、在膀胱移行細(xì)胞癌中,WWOX的表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌的組織學(xué)分級呈負(fù)相關(guān),即癌細(xì)胞分化程

23、度越高WWOX基因表達(dá)率越高;與臨床分期、復(fù)發(fā)無明確關(guān)系;膀胱癌細(xì)胞系。T24中,未見明確的WWOX表達(dá);
　　 3、WWOX在膀胱移行細(xì)胞癌的早期發(fā)生及發(fā)展中有重要作用,可能成為診斷膀胱移行細(xì)胞癌的早期診斷指標(biāo),并可能成為膀胱癌診斷、治療的新靶點(diǎn);
　　 4、通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法可以將抑癌基因WWOX高效、穩(wěn)定的整合進(jìn)人膀胱癌細(xì)胞株T24,建立了穩(wěn)定表達(dá)WWOX的亞細(xì)胞株;
　　 5、轉(zhuǎn)染W(wǎng)WOX基因可