WNT信號(hào)通路在hMSCs相關(guān)的II型骨質(zhì)疏松癥發(fā)生中的作用.pdf

1、第一部分 入骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化鑒定
　　 [目的]利用實(shí)驗(yàn)室已建立的hMSCs的培養(yǎng)方案,建立hMSCs的培養(yǎng)體系并做鑒定,為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供細(xì)胞來(lái)源。
　　 [方法]骨髓樣本取自美國(guó)波士頓市Brigham and Women's Hospital骨科因骨關(guān)節(jié)炎行全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)病人,從手術(shù)中分離的股骨頭中分離獲得。以密度梯度離心法獲得單個(gè)核細(xì)胞,以貼壁分離方法獲得hMSCs,在含有10％FBS的α-ME

2、M的培養(yǎng)基中培養(yǎng)和傳代擴(kuò)增。在成骨、成脂肪、成軟骨誘導(dǎo)下培養(yǎng),分別用ALP活性檢測(cè)、Alizarin Red S染色鑒定成骨細(xì)胞分化;利用Oil Red-O染色鑒定脂肪分化;利用Alcian blue染色鑒定軟骨細(xì)胞分化。
　　 [結(jié)果]原代培養(yǎng)24h部分細(xì)胞開(kāi)始貼壁伸展變形,48-72h后呈紡錘形或梭形,偶見(jiàn)形成集落,培養(yǎng)5-7d后見(jiàn)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞增殖迅速,可見(jiàn)多個(gè)細(xì)胞集落形成,當(dāng)培養(yǎng)至第12-14d時(shí),細(xì)胞已大部分融合,長(zhǎng)滿

3、培養(yǎng)皿底,細(xì)胞成長(zhǎng)梭形(成纖維樣外觀),有的細(xì)胞呈交叉重疊生長(zhǎng)。一般5-10d可傳一代,細(xì)胞可連續(xù)傳4-10代。成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后可檢測(cè)到ALP活性,并見(jiàn)Alizarin Red S染色陽(yáng)性細(xì)胞形成。成脂誘導(dǎo)分化后可見(jiàn)不同形狀的Oil Red-O陽(yáng)性染色細(xì)胞形成。成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化可見(jiàn)Alcian blue陽(yáng)性染色細(xì)胞形成。
　　 [結(jié)論]應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)方法從骨髓分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增獲得 hMSCs,具有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分

4、化的能力。
　　 第二部分 年齡和性別對(duì)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞WNT基因表達(dá)的影響
　　 [目的]已有的研究對(duì)于hMSCs的WNT基因表達(dá)的描述不相一致,作者推測(cè)年齡和性別和其它臨床因素的差異可以解釋過(guò)去的研究顯示的WNT基因在hMSCs中表達(dá)的不同。利用不同年齡和性別來(lái)源的hMSCs,檢測(cè)WNT基因的表達(dá),建立WNT基因在hMSCs的表達(dá)譜。
　　 [方法]骨髓樣本取自美國(guó)波士頓市Brigham and Women'

5、s Hospital骨科行全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)的病人,從手術(shù)中分離的股骨頭中分離獲得。共19例樣本來(lái)源的hMSCs被列入實(shí)驗(yàn)研究,來(lái)源包括12例女性和7例男性,年齡為36-85歲。其中9例為年輕樣本(＜50歲,平均42.0±4.6歲),10例為老年樣本(＞55歲,平均69.3±9.5歲)。12例樣本來(lái)源女性為37-85歲,平均58.6±16.0歲,7例樣本來(lái)源男性為36-82歲,平均52.6±16.0歲。將hMSCs在100mm組織培養(yǎng)皿中

6、培養(yǎng)用傳代至第2代(P2)和第4代(P4)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由于hMSCs來(lái)源于不同的個(gè)體,他們進(jìn)行全髖關(guān)節(jié)置換的手術(shù)時(shí)間不同,為保證實(shí)驗(yàn)條件的一致性,所有的實(shí)驗(yàn)均采用標(biāo)準(zhǔn)的條件。hMSCs經(jīng)體外培養(yǎng)、收集存儲(chǔ)于Trizol試劑,冷凍于-80℃。所有19個(gè)樣本收集齊全后同時(shí)進(jìn)行RNA分離實(shí)驗(yàn)。最后采用RT-PCR檢測(cè)所有WNT基因的表達(dá)。
　　 [結(jié)果]WNT2、3、4、5A、5B、6、7B、10B、11、13、14和16B共12

7、個(gè)WNT基因被檢測(cè)到在hMSCs中表達(dá)。相對(duì)于年老樣本來(lái)源的hMSCs,年輕來(lái)源者表達(dá)WNT7B和WNT14顯著升高。除此之外,WNT2和WNT13基因表達(dá)在年輕樣本來(lái)源hMSCs組顯示出表達(dá)顯著升高的趨勢(shì)。WNT基因表達(dá)和年齡相關(guān)性分析顯示:WNT7B、WNT14和WNT13的表達(dá)強(qiáng)度與年齡呈顯著反向相關(guān)。進(jìn)一步分析顯示,相對(duì)于女性來(lái)源的hMSCs樣本,男性來(lái)源的hMSCs中WNT16B表達(dá)顯著升高。WNT11在女性來(lái)源的hMSCs樣

8、本中表達(dá)呈現(xiàn)出顯著性升高的趨勢(shì)。在女性樣本來(lái)源的hMSCs,WNT13基因表達(dá)與年齡呈現(xiàn)顯著反向相關(guān)性。WNT4基因表達(dá)與年齡呈現(xiàn)顯著正向相關(guān)性。在男性hMSCs,WNT7B基因表達(dá)與年齡呈現(xiàn)顯著反向相關(guān)性,WNT14表達(dá)與年齡呈現(xiàn)反向相關(guān)性趨勢(shì)。
　　 [結(jié)論]在hMSCs,大部分的老化相關(guān)的WNT基因?qū)儆诮?jīng)典WNT基因,WNT2、7B、13和14是年齡相關(guān)性WNT基因;除此之外,WNT4、7B、13、14和16的表達(dá)呈現(xiàn)性別

9、特異性。
　　 第三部分 WNT信號(hào)通路對(duì)于hMSCs向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化的影響
　　 [目的]已有的采用小鼠脂肪前體細(xì)胞研究脂肪分化機(jī)制的結(jié)果表明,Wnt10b可以抑制脂肪分化并且促進(jìn)成骨細(xì)胞分化,Wnt4和Wnt5可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化,Wnt3a可以提高bmp2誘導(dǎo)的小鼠C3H10T1/2細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的能力。對(duì)于WNT信號(hào)通路在人脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化過(guò)程中的作用知之甚少。本實(shí)驗(yàn)設(shè)想W

10、NT信號(hào)通路調(diào)節(jié)hMSCs向脂肪細(xì)胞分化、成骨細(xì)胞分化和軟骨細(xì)胞分化,擬檢測(cè)經(jīng)典和非經(jīng)典WNT信號(hào)通路在hMSCs向脂肪細(xì)胞分化中的作用,并且采用一個(gè)小分子的β-catenin激活劑(SB-216763)模擬經(jīng)典WNT信號(hào)通路,闡述激活經(jīng)典WNT信號(hào)通路對(duì)于hMSCs向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化的影響。
　　 [方法]骨髓樣本取自美國(guó)波士頓市Brigham and Women's Hospital骨科因骨關(guān)節(jié)炎行全髖關(guān)節(jié)置

11、換手術(shù)病人,經(jīng)當(dāng)?shù)蒯t(yī)學(xué)倫理委員會(huì)IRB允許,從手術(shù)中分離的股骨頭中采用密度梯度離心分離獲得。hMSCs在成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng),采用RT-PCR檢測(cè)脂肪分化相關(guān)基因和WNT基因的表達(dá),Western Immunoblotting檢測(cè)β-catenin的表達(dá),采用一個(gè)小分子的β-catenin激活劑SB-216763模擬經(jīng)典WNT信號(hào)通路,檢測(cè)激活經(jīng)典WNT信號(hào)通路對(duì)于hMSCs向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化的影響。

12、>　　 [結(jié)果]對(duì)脂肪細(xì)胞的標(biāo)志基因的檢測(cè)結(jié)果顯示,在hMSCs成脂肪誘導(dǎo)1d后,檢測(cè)到PPARγ2和LPL的基因表達(dá),并隨著繼續(xù)培養(yǎng)而升高。Adipsin的表達(dá)隨著成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)亦呈進(jìn)行性升高。經(jīng)典WNT家族成員,包括WNT2、10B、13、14表達(dá)逐漸降低,同時(shí),非經(jīng)典WNT家族成員,包括WNT4和11表達(dá)逐漸升高。然而,WNT5A的表達(dá)基本保持不變。WNT11是唯一的一個(gè)在脂肪分化標(biāo)志基因出現(xiàn)表達(dá)升高之前表達(dá)改變的WNT

13、基因。SB-216763(5μM)可以升高β-catenin在hMSCs中的表達(dá)水平,并且通過(guò)阻斷PPARγ2、LPL和adipsin的基因表達(dá)抑制脂肪分化。與分子水平的作用一致,SB-216763模擬的經(jīng)典WNT信號(hào)通路抑制脂肪細(xì)胞分化呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性。激活經(jīng)典WNT信號(hào)通路可以抑制成骨細(xì)胞標(biāo)志基因ALP的表達(dá),抑制ALP的活性,促進(jìn)軟骨細(xì)胞標(biāo)志基因RUNX2和COLⅡ的表達(dá),促進(jìn)Ⅱ型膠原的分泌。
　　 [結(jié)論]在hMSC

14、s向脂肪細(xì)胞分化的過(guò)程中,非經(jīng)典WNT信號(hào)通路的WNT4和11而非WNT5A可能是主要促進(jìn)因子,而激活經(jīng)典WNT信號(hào)通路可以阻止hMSCs向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化,促進(jìn)其向軟骨細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)研究說(shuō)明在不同物種間,Wnt信號(hào)通路在向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化中所起的作用存在不同。
　　 第四部分 老化和性別對(duì)于hMSCs向脂肪細(xì)胞分化的影響
　　 [目的]本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加hMSCs發(fā)生一系列變化,向成骨細(xì)

15、胞分化能力降低。本實(shí)驗(yàn)采用不同年齡和性別個(gè)體來(lái)源的hMSCs進(jìn)行體外成脂誘導(dǎo)培養(yǎng),觀察其年齡和性別對(duì)hMSCs成脂肪細(xì)胞分化的影響,以期待揭示Ⅱ型骨質(zhì)疏松患者骨髓腔脂肪容量增多的機(jī)制。
　　 [方法]15例hMSCs被列入實(shí)驗(yàn)研究,來(lái)源包括8例女性和7例男性,年齡為17-90歲,包括5例年輕樣本和10例年老樣本。在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)18d后檢測(cè)不同年齡和性別組hMSCs形成脂肪細(xì)胞的差異。對(duì)于hMSCs脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)相

16、關(guān)實(shí)驗(yàn)研究,共有19例不同樣本來(lái)源的hMSCs被納入實(shí)驗(yàn),包括12例女性和7例男性,年齡為36-85歲。其中9例為年輕樣本,10例為老年樣本,在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下,檢測(cè)脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞標(biāo)志基因在不同年齡和性別組之間表達(dá)的差異。
　　 [結(jié)果]年老來(lái)源的hMSCs在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下,形成的脂肪細(xì)胞數(shù)目是年輕來(lái)源的hMSCs的2.35倍,但是統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著性差異(P=0.30)。不同樣本來(lái)源的hMSCs形成脂肪細(xì)胞數(shù)目和年齡的相關(guān)性分

17、析顯示,體外成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下,hMSCs分化成脂肪細(xì)胞的能力和年齡無(wú)顯著相關(guān)性(Spearman,r=0.01899,P=0.95)。脂肪細(xì)胞的標(biāo)志基因PPARγ2、LPL、Adipsin在年老來(lái)源的hMSCs中表達(dá)高于年輕來(lái)源的hMSCs,但是統(tǒng)計(jì)學(xué)均無(wú)顯著性差異。成骨細(xì)胞標(biāo)志基因RUNX2在年老來(lái)源的hMSCs中表達(dá)高于年輕來(lái)源者,而OC、ALP的表達(dá)在年老來(lái)源的hMSCs中高于年輕來(lái)源者,三者均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?；虮磉_(dá)和年齡相關(guān)性