miR-34a在高脂高糖誘導(dǎo)肝細(xì)胞衰老中的作用及機(jī)制初探.pdf

1、目的：隨著人們生活水平的提高，高脂高糖飲食已經(jīng)成為我們的日常飲食。隨之而來的非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NALFD)在我國(guó)的發(fā)病率越來越高，且呈低齡化發(fā)病趨勢(shì)，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類公共健康的主要疾病之一。為此我們擬在體外細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境下應(yīng)用高脂高糖調(diào)控肝細(xì)胞增殖與衰老狀況模擬NAFLD的肝細(xì)胞病變，為尋找該類疾病有效干預(yù)靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)。
　　方法：(1)棕櫚酸聯(lián)合葡萄糖作用于

2、BNL CL.2細(xì)胞48小時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，檢測(cè)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶，衰老相關(guān)蛋白乙?；疨53（Ac-P53）、P21、γH2AX以及細(xì)胞周期相關(guān)基因CDK4/6、Rb1的表達(dá)。(2)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)經(jīng)棕櫚酸和葡萄糖處理24小時(shí)后BNL.CL2細(xì)胞內(nèi)miR-34a的表達(dá)水平。(3)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-34a mimics至BNL.CL2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后檢測(cè)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶、SIRT1、Ac-P53、P21以及γH2AX蛋白

3、的表達(dá)；轉(zhuǎn)染24小時(shí)后檢測(cè)CDK4/6和Rb1 mRNA的表達(dá)。(4)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor至BNL.CL2細(xì)胞，6小時(shí)后，棕櫚酸聯(lián)合葡萄糖處理細(xì)胞，處理48小時(shí)后檢測(cè)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶、SIRT1、Ac-P53以及P21蛋白的表達(dá)；處理24小時(shí)后檢測(cè)CDK4/6和Rb1 mRNA的表達(dá)。(5)加入SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇作用于BNL.CL2細(xì)胞，8小時(shí)后，棕櫚酸聯(lián)合葡萄糖處理細(xì)胞，處理48小時(shí)后檢測(cè)衰老相關(guān)β-

4、半乳糖苷酶、SIRT1、Ac-P53以及P21蛋白的表達(dá)；處理24小時(shí)后檢測(cè)CDK4/6和Rb1 mRNA的表達(dá)。(6)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染p53 siRNA至BNL.CL2細(xì)胞，6小時(shí)后，棕櫚酸聯(lián)合葡萄糖處理細(xì)胞，處理48小時(shí)后檢測(cè)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶、SIRT1、Ac-P53以及P21蛋白的表達(dá)；處理24小時(shí)后檢測(cè)miR-34a、CDK4/6以及Rb1 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：(1)體外成功建立肝細(xì)胞衰老的細(xì)胞模型：①M(fèi)TT和β-半

5、乳糖苷酶染色結(jié)果顯示棕櫚酸和葡萄糖的濃度分別為50μM和100mM時(shí)，細(xì)胞增殖潛能衰竭，衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶表達(dá)增加，故而確定為最佳處理濃度；②用棕櫚酸和葡萄糖的最佳濃度處理BNL.CL2細(xì)胞后，衰老相關(guān)蛋白Ac-P53、P21及γH2AX的表達(dá)增加，CDK4/6 mRNA表達(dá)減少，Rb1 mRNA表達(dá)增加。(2)棕櫚酸聯(lián)合葡萄糖處理BNL.CL2細(xì)胞后，miR-34a表達(dá)水平升高。(3)BNL.CL2細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-34a mi

6、mics后，衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶表達(dá)增加，SIRT1蛋白表達(dá)減少，Ac-P53、P21及γH2AX蛋白表達(dá)增加，CDK4/6 mRNA表達(dá)減少，Rb1 mRNA表達(dá)增加。(4)建立的肝細(xì)胞衰老模型通過miR-34a inhibitor干預(yù)后，與衰老模型組相比，衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶表達(dá)減少，SIRT1蛋白表達(dá)增加，Ac-P53及P21蛋白表達(dá)減少，CDK4/6 mRNA表達(dá)增加，Rb1 mRNA表達(dá)減少。(5)建立的肝細(xì)胞衰老模型通過

7、SIRT1激動(dòng)劑干預(yù)后，與衰老模型組相比，衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶表達(dá)減少，SIRT1蛋白表達(dá)增加，Ac-P53及P21蛋白表達(dá)減少，CDK4/6 mRNA表達(dá)增加，Rb1mRNA表達(dá)減少。(6)建立的肝細(xì)胞衰老模型通過p53 siRNA干預(yù)后，與衰老模型組相比，衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶表達(dá)減少，miR-34a表達(dá)減少，SIRT1蛋白表達(dá)增加，Ac-P53及P21蛋白表達(dá)減少，CDK4/6 mRNA表達(dá)增加，Rb1 mRNA表達(dá)減少。