miR-34a在高脂高糖誘導肝細胞衰老中的作用及機制初探.pdf

1、目的：隨著人們生活水平的提高，高脂高糖飲食已經(jīng)成為我們的日常飲食。隨之而來的非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NALFD)在我國的發(fā)病率越來越高，且呈低齡化發(fā)病趨勢，已經(jīng)成為嚴重威脅人類公共健康的主要疾病之一。為此我們擬在體外細胞培養(yǎng)環(huán)境下應用高脂高糖調(diào)控肝細胞增殖與衰老狀況模擬NAFLD的肝細胞病變，為尋找該類疾病有效干預靶點提供基礎。
　　方法：(1)棕櫚酸聯(lián)合葡萄糖作用于

2、BNL CL.2細胞48小時，誘導細胞衰老，檢測衰老相關β-半乳糖苷酶，衰老相關蛋白乙?；疨53（Ac-P53）、P21、γH2AX以及細胞周期相關基因CDK4/6、Rb1的表達。(2)實時定量PCR技術檢測經(jīng)棕櫚酸和葡萄糖處理24小時后BNL.CL2細胞內(nèi)miR-34a的表達水平。(3)瞬時轉(zhuǎn)染miR-34a mimics至BNL.CL2細胞，轉(zhuǎn)染48小時后檢測衰老相關β-半乳糖苷酶、SIRT1、Ac-P53、P21以及γH2AX蛋白

3、的表達；轉(zhuǎn)染24小時后檢測CDK4/6和Rb1 mRNA的表達。(4)瞬時轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor至BNL.CL2細胞，6小時后，棕櫚酸聯(lián)合葡萄糖處理細胞，處理48小時后檢測衰老相關β-半乳糖苷酶、SIRT1、Ac-P53以及P21蛋白的表達；處理24小時后檢測CDK4/6和Rb1 mRNA的表達。(5)加入SIRT1激動劑白藜蘆醇作用于BNL.CL2細胞，8小時后，棕櫚酸聯(lián)合葡萄糖處理細胞，處理48小時后檢測衰老相關β-

4、半乳糖苷酶、SIRT1、Ac-P53以及P21蛋白的表達；處理24小時后檢測CDK4/6和Rb1 mRNA的表達。(6)瞬時轉(zhuǎn)染p53 siRNA至BNL.CL2細胞，6小時后，棕櫚酸聯(lián)合葡萄糖處理細胞，處理48小時后檢測衰老相關β-半乳糖苷酶、SIRT1、Ac-P53以及P21蛋白的表達；處理24小時后檢測miR-34a、CDK4/6以及Rb1 mRNA的表達。
　　結(jié)果：(1)體外成功建立肝細胞衰老的細胞模型：①MTT和β-半

5、乳糖苷酶染色結(jié)果顯示棕櫚酸和葡萄糖的濃度分別為50μM和100mM時，細胞增殖潛能衰竭，衰老相關β-半乳糖苷酶表達增加，故而確定為最佳處理濃度；②用棕櫚酸和葡萄糖的最佳濃度處理BNL.CL2細胞后，衰老相關蛋白Ac-P53、P21及γH2AX的表達增加，CDK4/6 mRNA表達減少，Rb1 mRNA表達增加。(2)棕櫚酸聯(lián)合葡萄糖處理BNL.CL2細胞后，miR-34a表達水平升高。(3)BNL.CL2細胞瞬時轉(zhuǎn)染miR-34a mi

6、mics后，衰老相關β-半乳糖苷酶表達增加，SIRT1蛋白表達減少，Ac-P53、P21及γH2AX蛋白表達增加，CDK4/6 mRNA表達減少，Rb1 mRNA表達增加。(4)建立的肝細胞衰老模型通過miR-34a inhibitor干預后，與衰老模型組相比，衰老相關β-半乳糖苷酶表達減少，SIRT1蛋白表達增加，Ac-P53及P21蛋白表達減少，CDK4/6 mRNA表達增加，Rb1 mRNA表達減少。(5)建立的肝細胞衰老模型通過

7、SIRT1激動劑干預后，與衰老模型組相比，衰老相關β-半乳糖苷酶表達減少，SIRT1蛋白表達增加，Ac-P53及P21蛋白表達減少，CDK4/6 mRNA表達增加，Rb1mRNA表達減少。(6)建立的肝細胞衰老模型通過p53 siRNA干預后，與衰老模型組相比，衰老相關β-半乳糖苷酶表達減少，miR-34a表達減少，SIRT1蛋白表達增加，Ac-P53及P21蛋白表達減少，CDK4/6 mRNA表達增加，Rb1 mRNA表達減少。