坦布蘇病毒的分離鑒定及熒光定量RT-PCR檢測方法的建立與應用.pdf

1、坦布蘇病毒感染是由坦布蘇病毒(Tembusu virus，TMUV)引起的一種以蛋鴨產蛋量下降和雛鴨神經癥狀為主要特征的傳染性疾病。主要表現為發(fā)生迅速、流行范圍廣、傳播速度快、發(fā)病率和死亡率都較高，嚴重威脅我國養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展，加強該病的研究對保護和促進我國養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展具有重要意義。
　　 TMUV感染于2010年由曹貞貞、張大丙首次報道，之后在我國的大部分養(yǎng)鴨地區(qū)流行。建立精確、快速的檢測方法是控制TMUV的有效措施。本研究從發(fā)病

2、雛鴨腦內分離到一株TMUV，并對該病毒的生物學特性進行了研究;建立了熒光定量PCR的檢測方法，利用建立的方法對雛鴨和蛋雞不同組織器官中的TMUV分布情況進行了檢測，從而為TMUV致病機理的研究提供理論依據
　　 一、坦布蘇病毒SDLZ株的分離鑒定
　　 通過鴨胚尿囊腔接種，從疑似TMUV感染的病料組織中分離得到一株病毒，通過RT-PCR方法和動物回歸試驗對分離株進行鑒定，并對該毒株的培養(yǎng)特性進行了研究。分離毒株RT-PC

3、R鑒定結果顯示，PCR產物與設計引物預期產物大小一致，克隆測序結果與GenBank中的TMUV相應片段的核苷酸同源性均為100％。分離毒株人工感染雛鴨后的癥狀及病理變化與自然感染的病例相同;鴨胚半數致死量DELD50為10-4.5/0.2mL;該毒株可在雞胚、鴨胚、鴨胚成纖維細胞(DEF)、非洲(綠)猴細胞(Vero)中培養(yǎng)增殖，并引起胚體和細胞病變。上述結果表明，分離毒株為TMUV，命名為SDLZ株。
　　 二、坦布蘇病毒熒光

4、定量PCR快速檢測方法的建立與應用
　　 根據本實驗室測定的一株TMUV全基因序列（SDLZ株），選擇該序列的E基因和NS5基因作為病毒蛋白基因，分別在其保守區(qū)域設計并合成特異性引物，擴增長度為225bp和264 bp的目的片段。以β-actin肌動蛋白基因為內參基因，擴增長度為139 bp的目的片段。將PCR擴增的的片段分別連接到pMD18-T載體上構建重組質粒，經篩選、鑒定純化后，倍比稀釋作為標準品，用于實時熒光定量PCR中

5、NS5、E基因及內參基因β-actin標準曲線的構建，建立檢測坦布蘇病毒的相對熒光定量RT-PCR方法。研究結果表明，構建的熒光定量PCR檢測方法檢測10倍梯度稀釋的β-actin、NS5和E質粒標準品，最小檢出模板濃度約為10 Copies/μL，E基因、NS5基因和β-actin基因的Ct值與陽性質粒標準品的濃度均成良好的線性關系，標準曲線線性關系R2值均在0.99以上;特異性結果表明，E基因、NS5基因和β-actin基因的熔解曲

6、線單一，表明擴增產物單一，無非特異性產物和引物二聚體;重復性結果顯示，E基因、NS5基因和β-actin基因的批內、批間變異系數均小于0.5％。本研究建立的SYBR GreenⅠ熒光定量RT-PCR方法快速、穩(wěn)定、特異性強、靈敏度高，可以用于TMUV早期檢測，以便于早發(fā)現，以及時采取相應的防治措施，減少TMUV感染對養(yǎng)鴨業(yè)造成的危害。
　　 三、坦布蘇病毒在雛鴨體內的動態(tài)分布規(guī)律
　　 將純化的TMUV人工感染3日齡雛鴨

7、，定期剖殺攻毒組和對照組雛鴨，用建立的熒光定量PCR方法對各組織病料進行檢測。結果顯示:試驗組雛鴨人工感染3d后可在各個組織中檢測到TMUV，感染后7d在各組織中的相對表達量達到最大，感染15 d天仍能在各組織中檢測到病毒。TMUV相對表達量最高的器官為胰臟、腦、心臟，相對表達量在0.5～0.8之間，表明這些器官是TMUV感染后的主要靶器官。其次為肝臟、脾臟，相對表達量在0.4～0.6之間。表達量較低的為法氏囊和肺臟，相對表達量在0.2

8、～0.4之間
　　 四、坦布蘇病毒在蛋雞體內的分布規(guī)律
　　 應用建立的熒光定量PCR方法檢測TMUV感染產蛋雞不同組織在不同時間段TMUV的相對表達量的變化，結果顯示:攻毒后3d在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、胰臟、卵泡、輸卵管中均可檢測到坦布蘇病毒，各組織TMUV的相對表達量都較高，其中卵泡和輸卵管最高;攻毒后5d肝臟、脾臟、肺臟、胰臟的病毒含量減少，卵泡和輸卵管含量沒有變化;攻毒后9d，只在卵泡中檢測到病毒。坦布蘇病毒相