家蠶腦轉(zhuǎn)錄組分析和轉(zhuǎn)錄因子BmSGF1的功能及其進(jìn)化研究.pdf

1、家蠶（Bombyx mori）起源于中國野桑蠶，這個(gè)過程經(jīng)歷了漫長的人工選擇馴化，它們在形態(tài)、生長發(fā)育、產(chǎn)卵、產(chǎn)絲量以及飛行能力方面都存在著很大的差異。作為鱗翅目的模式昆蟲，家蠶具有遺傳資源豐富、世代短、易于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)、子代群體大等優(yōu)點(diǎn)，與雙翅目模式昆蟲果蠅相比，家蠶的個(gè)體比較大，實(shí)驗(yàn)操作起來比較容易，并且家蠶的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分泌細(xì)胞極為豐富，神經(jīng)細(xì)胞相對比較大，在實(shí)驗(yàn)過程中便于更好的觀察和研究。另外，隨著家蠶全基因組測序的完成，對家蠶

2、神經(jīng)發(fā)育的研究必將會(huì)推動(dòng)家蠶功能基因的研究進(jìn)展，同時(shí)能夠?qū)倚Q抗病以及蠶絲產(chǎn)業(yè)起到極大的推進(jìn)作用。因此，家蠶作為一種理想的實(shí)驗(yàn)材料，將其作為分析神經(jīng)功能的模型，對于揭示生物神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成機(jī)制以及生物發(fā)育的研究具有非常重要的意義。在生物體中，神經(jīng)系統(tǒng)能夠起到主導(dǎo)作用，它可以通過調(diào)節(jié)和控制身體的各個(gè)系統(tǒng)使機(jī)體適應(yīng)復(fù)雜多變的外界環(huán)境。從腔腸動(dòng)物水螅簡單的網(wǎng)狀神經(jīng)系統(tǒng)到人類高級(jí)復(fù)雜且能夠精準(zhǔn)調(diào)控的神經(jīng)中樞系統(tǒng)，在生物進(jìn)化過程中神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)以及功

3、能經(jīng)歷了極為巨大的進(jìn)步及發(fā)展，由分散到集中，由簡單到復(fù)雜。
　　第二代測序技術(shù)為基因組學(xué)研究插上了騰飛的翅膀，它加快了人們對于新基因的挖掘以及單核苷酸多態(tài)性（SNP）和可變剪接等方面的研究。本研究基于RNA-Seq技術(shù)，對家蠶5齡第3天的腦轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，包括對基因表達(dá)注釋，可變剪接的檢測等，利用分子克隆、抗體染色以及RNAi等技術(shù)對轉(zhuǎn)錄因子BmSGF1的功能進(jìn)行研究，并對其在家蠶和野蠶中的進(jìn)化進(jìn)行了初探。主要研究結(jié)果如下：

4、>　　（1）以家蠶5齡第3天的大腦轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)為分析材料，首先對Illumina的下級(jí)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾處理和質(zhì)控，得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，從而確保數(shù)據(jù)的可靠性。共獲得27958302個(gè)讀序，總核苷酸數(shù)達(dá)到2.8Gb，最終組裝出30603條Unigene。對家蠶大腦樣品中的基因表達(dá)進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，樣品共表達(dá)12219個(gè)基因，且覆蓋度較高。
　?。?）對樣品進(jìn)行Unigene功能注釋，能夠注釋到NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫（NR）上的Unigene共1

5、9992個(gè)；能夠比對上COG數(shù)據(jù)庫的Unienge共有12891個(gè)，共涉及了25種不同的功能；有9111個(gè)unigenes（23.6％）能夠注釋到GO功能分類中；和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對結(jié)果顯示共有12468個(gè)Unigene注釋到252個(gè)Pathways。
　?。?）通過潛在基因model和現(xiàn)有基因注釋進(jìn)行比較，對樣品中10119個(gè)轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)進(jìn)行了優(yōu)化。并且通過reads的分布以及參考基因的注釋集合，在參考基因組中找出32467個(gè)

6、新的轉(zhuǎn)錄本（Novel Transcrip Unit，Novel TU）。通過對家蠶腦轉(zhuǎn)錄組中可變剪接事件的檢測，發(fā)現(xiàn)有5480個(gè)基因經(jīng)歷了可變剪接事件，經(jīng)歷的最多的可變剪切形式是Alternative3′splicing。
　?。?）用Bmsgf1的全長序列作為抗原制備家兔多克隆抗體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-Bmsgf1，并在大腸桿菌BL21（DE3）中原核表達(dá)，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果表明，His-BmSGF1的重

7、組蛋白主要以包涵體的形式存在，然后對該重組蛋白純化，免疫2只家兔制備多克隆抗體。ELISA實(shí)驗(yàn)以及Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明所制備的多克隆抗體能和抗原起特異的免疫反應(yīng)。
　　（5）用家蠶5齡第3天的家蠶不同組織的樣本對 Bmsgf1進(jìn)行表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)Bmsgf1能夠在頭部、大腦、中部絲腺、后部絲腺、馬氏管和中腸等器官表達(dá)，抗體染色也證實(shí)了這一點(diǎn)。BmSGF1和Bmsage在家蠶神經(jīng)和絲腺中共表達(dá)，這也說明這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因

8、子可能存在一定的調(diào)控關(guān)系。
　?。?）采用RNAi技術(shù)對BmSGF1的功能進(jìn)行研究。在BmSGF1的全長序列中，選取了兩段不同的片段作為其制備雙鏈RNA的目的片段，稱為Bmsgf1-1和Bmsgf1-2，長度分別為355bp和510bp，并分別注射到家蠶的早期胚胎，用注射egfp雙鏈RNA的家蠶同一時(shí)期的胚胎進(jìn)行對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照胚胎相比，Bmsgf1-2和對照并沒有差別，但是Bmsgf1-1的表型差別比較明顯，注射Bms

9、gf1-1雙鏈RNA的胚胎其神經(jīng)發(fā)育嚴(yán)重異常，軸索的發(fā)育受到影響。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR結(jié)果表明，和對照組以及注射Bmsgf1-2雙鏈的胚胎相比，注射Bmsgf1-1雙鏈RNA的實(shí)驗(yàn)組中Bmsgf1的表達(dá)量顯著降低。以上結(jié)果說明，Bmsgf1在家蠶神經(jīng)發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。
　?。?）在Bmsgf1 RNAi的胚胎中，對Bmsage的表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果表明Bmsage的表達(dá)量和Bmsgf1的趨勢相同，即在注射Bmsgf1-1

10、的胚胎中，相比于對照組和Bmsgf1-2胚胎，其表達(dá)量顯著減少。這也說明，在胚胎期Bmsgf1能夠調(diào)控Bmsage的表達(dá)。
　　（8）用MEGA5.0軟件對家蠶SGF1的蛋白序列及其其他物種的同源序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果顯示，系統(tǒng)發(fā)育樹和物種樹一致，說明該基因在進(jìn)化過程中高度保守。從系統(tǒng)發(fā)育樹來看，絲盤蟲（Trichoplax adhaerens）有可能是FoxA家族的祖先物種。從無脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物，該基因發(fā)生了基因復(fù)制。

11、家蠶SGF1蛋白和鱗翅目的大紅斑蝶以及甜菜夜蛾的SGF1蛋白聚在一個(gè)枝上，和其他的非脊椎動(dòng)物遺傳距離較遠(yuǎn)。
　?。?）利用家蠶SGF1、果蠅的Fork head以及人的FOXA2蛋白序列進(jìn)行比對，比對結(jié)果顯示其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Region I）以及2個(gè)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域II和III（Regions II and III）是非常保守的。但是相比于果蠅和人的蛋白序列，家蠶的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域IV and V（Regions IV and V

12、）卻有很大的不同。
　　（10）基于BmSGF1和Bmsage在家蠶中的重要地位，對其在野桑蠶到家蠶的微進(jìn)化進(jìn)行了研究。全序列的家蠶核苷酸多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，Bmsgf1和Bmsage基因的πtotal值分別為0.00344和0.00056；野桑蠶核苷酸多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)Bmsgf1和Bmsage基因的πtotal值分別為0.00718和0.01038。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，Bmsgf1有52%的野桑蠶核苷酸多樣性在家蠶中丟失，而Bmsage有9

13、4.6%的缺失。如果基于群體多態(tài)性參數(shù)（θw）來分析，結(jié)果顯示，家蠶中Bmsgf1和Bmsage基因θw的值分別是0.00430和0.00200；野桑蠶中Bmsgf1和Bmsage基因分別是0.00714和0.01142。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，Bmsgf1有39.8%的野桑蠶核苷酸多樣性在家蠶中丟失，而Bmsage有82.5%的缺失。通過核苷酸多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)家蠶Bmsage的核苷酸多態(tài)性要顯著的低于野桑蠶。中性檢驗(yàn)結(jié)果表明sage基因顯著的偏

14、離了中性進(jìn)化模型。并且對家蠶sage基因的兩側(cè)區(qū)域和基因進(jìn)行了核苷酸多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)它們的核苷酸多態(tài)性趨勢可以呈現(xiàn)“V”型。在長期的進(jìn)化過程中，轉(zhuǎn)錄因子Bmsage受到了人工選擇。
　?。?1）對家蠶和野桑蠶中sage基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，相比于野桑蠶，sage在家蠶表達(dá)量的升高呈極顯著狀態(tài)，且通過對比野桑蠶和家蠶7532的繭絲率來看，它們的趨勢相近。這個(gè)結(jié)論暗示著，在家蠶馴化過程中，sage基因受到人工選擇，并且很有可能和繭的大