實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)用于土壤中煙草青枯病菌的定量檢測(cè)及動(dòng)態(tài)分析.pdf

1、煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的煙草細(xì)菌性病害，主要發(fā)生在溫度較高的熱帶、亞熱帶地區(qū)。近年來我國(guó)煙草青枯病菌發(fā)病地區(qū)逐步增加，在各大煙區(qū)均有發(fā)生，青枯病受環(huán)境因素影響較大，在部分年份爆發(fā)式發(fā)生，對(duì)煙葉的生產(chǎn)產(chǎn)生毀滅性打擊，對(duì)我國(guó)的煙草農(nóng)業(yè)產(chǎn)生極大危害。近幾年來，由于氣候等多方面的原因，該病逐步向北方煙區(qū)擴(kuò)展，在山東、河南、陜西及遼寧等省都有發(fā)生，局部地區(qū)為害較重。
　　煙草青枯病菌在

2、土壤或者堆肥中越冬，不同條件下存活時(shí)間差異很大，煙草青枯病是高溫高濕型病害，受溫度和濕度影響很大。因此本實(shí)驗(yàn)探究在不同的環(huán)境條件下青枯病菌的生長(zhǎng)繁育狀況，以期探索青枯病青枯病菌的病原數(shù)量與青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)之間的關(guān)系本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)了兩對(duì)煙草青枯病菌的特異性檢測(cè)引物，在煙苗移栽后，對(duì)煙田中煙草青枯病菌的生物量進(jìn)行定量檢測(cè)，得到土壤中煙草青枯病菌的消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)曲線。同時(shí)結(jié)合當(dāng)?shù)氐臍鉁睾徒邓治隽藷煵萸嗫莶〉陌l(fā)病率及

3、病情指數(shù)與病原菌種群數(shù)量之間的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下：
　　1．設(shè)計(jì)并驗(yàn)證了引物的特異性?；跓煵萸嗫莶【鷉lagellin(fliC) gene核苷酸序列保守區(qū)段，設(shè)計(jì)了煙草青枯病菌的特異性引物Flic-f1/Flic-r1、Flic-f2/Flic-r2，采用CTAB法提取煙草青枯病菌的DNA，利用常規(guī)的PCR擴(kuò)增，得到200bp左右的兩條目的片段。和從青枯病菌發(fā)病土壤中分離得到的其他病菌以及實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的其他菌株DNA為模板進(jìn)

4、一步PCR檢測(cè)。電泳結(jié)果顯示只有煙草青枯病菌能夠得到目的片段，其他菌株DNA均未得到目的片段，驗(yàn)證了所設(shè)計(jì)引物的特異性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用Flic-f1/Flic-r1。
　　2．優(yōu)化了常規(guī)PCR和Real-time PCR的反應(yīng)條件，并檢測(cè)了引物的靈敏度。在48℃-62℃之間分別在常規(guī)PCR和基于SYBR Green染料的Real-time PCR進(jìn)行最適溫度的優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Flic-f1/Flic-r1在57.7℃得到最佳的PCR結(jié)

5、果。10倍梯度稀釋所提取的青枯病菌的標(biāo)準(zhǔn)DNA，經(jīng)常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢驗(yàn)，結(jié)果顯示常規(guī)PCR檢測(cè)下限為1.0×10-4ng/μL，試試熒光定量PCR檢測(cè)下限為1.0×10-5ng/μL。
　　3．繪制了Ct值與煙草青枯病菌DNA濃度對(duì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以提取的青枯病菌的標(biāo)準(zhǔn)DNA10倍濃度梯度稀釋為模板，使用Bio-Rad-iQ5進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。根據(jù)軟件設(shè)置，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，以ct值15-30為準(zhǔn)，決定

6、系數(shù)為0.998，擴(kuò)增效率為99.6％，線性范圍可達(dá)個(gè)6個(gè)數(shù)量級(jí)，溶解峰單一，無引物二聚體產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)證明該標(biāo)準(zhǔn)曲線能用于土壤中的煙草青枯病菌定量檢測(cè)。
　　4．繪制田間煙草青枯病菌的病情指數(shù)變化曲線，探究了溫度和降水對(duì)煙草青枯病菌的數(shù)量影響之間關(guān)系。在三地六點(diǎn)分別五點(diǎn)觀測(cè)取樣，記錄了發(fā)病率，同時(shí)進(jìn)行了病情指數(shù)的計(jì)算，并且利用熒光定量PCR技術(shù)測(cè)算土壤中的實(shí)時(shí)青枯菌量，結(jié)合當(dāng)?shù)貧庀笳就奖O(jiān)測(cè)的氣象資料，繪制了氣象變化中降水和溫度的變