土壤中煙草青枯病菌分子檢測方法研究.pdf

1、煙草青枯?。═obacco bacterial wilt disease）是由茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum E.F.Smith）引起的嚴(yán)重危害世界煙草生產(chǎn)的毀滅性細(xì)菌病害。R. solanacearum是一種分布范圍廣、危害大且難以防治的土傳病原細(xì)菌，其隨植株病殘體遺落于土壤中成為植物青枯病的主要侵染源。該病菌主要從根部侵入，然后通過維管束傳播，在極短的時間內(nèi)引起整個植株的枯萎、死亡。由于目前缺乏特效的藥劑

2、和抗性品種，煙草青枯病的病后治理難度相當(dāng)大，因此在發(fā)生前快速、準(zhǔn)確地檢測潛伏在田間土壤中R. solanacearum的數(shù)量是預(yù)防該病害發(fā)生的有效策略之一。傳統(tǒng)上煙草青枯病菌的檢測方法在一定程度上存在著檢測周期長、操作復(fù)雜、靈敏度不高的缺點(diǎn)，不能很好的滿足檢測工作的要求。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)因其具有快速、特異、靈敏的特點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測。本研

3、究即運(yùn)用PCR技術(shù)，建立了土壤中 R. solanacearum的常規(guī) PCR和實(shí)時熒光定量 PCR(Real time PCR，RTi-PCR）檢測體系，并初步研制出快速檢測試劑盒。其研究成果將準(zhǔn)確、快速地定量檢測煙草種植田間土壤中的R. solanacearum和對田間病害發(fā)生情況進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，為煙草青枯病的防治提供有力依據(jù)，具有重要的生產(chǎn)意義和科學(xué)價值。論文主要研究結(jié)果如下：
　?、俳⒘藷煵萸嗫莶【某Ｒ?guī) PCR檢測體系。

4、利用序列比對得到的R. solanacearum獨(dú)有核苷酸序列設(shè)計特異性引物對R.sol1/R.sol2，對PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了常規(guī)PCR檢測體系，其DNA擴(kuò)增靶帶為331 bp。該檢測體系特異性強(qiáng)、靈敏度高，檢測靈敏度可以達(dá)到100 fg/μL，可用于土壤中 R. solanacearum的檢測。
　?、诟倪M(jìn)了土壤中微生物總基因組DNA的提取方法，解決了土壤中腐殖酸、腐殖酸樣物、酚類化合物、重金屬、不明沉淀物、菌體裂解

5、成分和RNA等PCR抑制物質(zhì)導(dǎo)致DNA不能直接用作PCR擴(kuò)增模板的難題，采用此方法在2.5 h內(nèi)提取得到可直接用于PCR擴(kuò)增的高質(zhì)量的土壤DNA。
　?、凼状谓⒘送寥乐袩煵萸嗫莶【腞Ti-PCR檢測體系。運(yùn)用特異性引物對R.sol1/R.sol2優(yōu)化建立了SYBR Green I RTi-PCR檢測體系；利用引物探針設(shè)計軟件設(shè)計 TaqMan雜交探針 RSprobe和特異性引物對R.sol1/R.sol2優(yōu)化建立了TaqMan

6、探針RTi-PCR檢測體系；采用R.sol1/R.sol2擴(kuò)增的331 bp片段構(gòu)建的重組質(zhì)粒梯度稀釋液建立了RTi-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。兩種RTi-PCR檢測體系對DNA重組質(zhì)粒靶片段的檢測靈敏度均可達(dá)1.2 fg/μL，比常規(guī)PCR的靈敏度高出兩個數(shù)量級，可以準(zhǔn)確地定量檢測土壤中的R. solanacearum，實(shí)現(xiàn)了田間病害的早期診斷。
　?、軐碜蕴镩g的土壤樣品進(jìn)行了實(shí)際檢測，證明了所建立的PCR檢測體系是穩(wěn)定可靠的。分別采用