高強(qiáng)度聚焦超聲制備DC瘤苗及其免疫作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：①應(yīng)用高強(qiáng)度聚焦超聲（high intensity focused ultrasound，HIFU）輻照腫瘤細(xì)胞獲取腫瘤抗原并致敏樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC），制備DC腫瘤疫苗。觀察此方法制備的DC瘤苗免疫小鼠后機(jī)體產(chǎn)生的抗腫瘤主動(dòng)免疫保護(hù)作用。②為應(yīng)用DC介導(dǎo)的腫瘤免疫預(yù)防和治療開(kāi)辟新途徑。③為HIFU開(kāi)辟新的應(yīng)用領(lǐng)域。 方法：①應(yīng)用10ng/ml的粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte

2、-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）和10ng/ml的白介素-4（interleukin-4，IL-4）聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞，光鏡和電鏡觀察DC發(fā)育過(guò)程中形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表面分子CD80、CD86、H-2K<'d>及I-A<'d>的表達(dá)情況。②應(yīng)用不同劑量的HIFU輻照體外培養(yǎng)的CT-26腫瘤細(xì)胞后，用胎盼蘭染色測(cè)定活細(xì)胞數(shù)、觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；MTI法分析HIF

3、U劑量與腫瘤細(xì)胞存活率的關(guān)系，從而找出制備腫瘤抗原的工作劑量。③用劑量為1000W/cm<'2>×30s的HIFU輻照體外培養(yǎng)的BALB/c小鼠CT-26結(jié)腸癌細(xì)胞，獲取腫瘤抗原，與體外培養(yǎng)擴(kuò)增第5天的DC共孵育，制備DC瘤苗。④DC瘤苗的體內(nèi)主動(dòng)免疫保護(hù)作用：HIFU輻照法制備的：DC瘤苗（HIFU組）一次性免疫正常BALB/c小鼠（5×10<'5>/只，含250μl RPMI1640），7天后再皮下接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CT-26結(jié)腸癌細(xì)

4、胞（5×10<'5>/只），然后觀察腫瘤發(fā)生時(shí)間、20天時(shí)腫瘤重量和腫瘤體積及小鼠生存時(shí)間、生存率等。并與反復(fù)凍融法制備的DC瘤苗（凍融組）和等量RPMI1640（陰性對(duì)照組）進(jìn)行比較。 結(jié)果：①用GM-CSF和IL-4聯(lián)合培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞3天后，可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，并呈簇生長(zhǎng)。培養(yǎng)第6～8天，細(xì)胞表面出現(xiàn)較多毛刺樣突起，拉長(zhǎng)，為典型的DC特征。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，DC高表達(dá)CD80、CD86、H-2K<'d>及I

5、-A<'d>等。②應(yīng)用不同劑量的HIFU輻照CT-26細(xì)胞，隨著劑量的增加腫瘤細(xì)胞的存活率迅速減少，腫瘤細(xì)胞的碎片逐漸增多。超聲劑量為1000W/cm<'2>×30s時(shí)，細(xì)胞全部死亡，失去細(xì)胞形態(tài)并全部被撕裂成碎片。因此，選用1000W/cm<'2>×30s作為制備腫瘤細(xì)胞裂解液（腫瘤細(xì)胞抗原）的工作劑量。③HIFU組、凍融組分別與陰性對(duì)照組比較腫瘤發(fā)生時(shí)間、20天腫瘤重量、體積等差異均有顯著性意義（P＜0.01或P＜0.05）；HIF

6、U組與凍融組比較，腫瘤重量及體積差異亦均有顯著性意義（P＜0.05）；HIFU組、凍融組分別和陰性對(duì)照組小鼠生存時(shí)間中位數(shù)分別是32.5天、28.5天和24.5天，三組之間生存率比較，x<'2>=22.35，P＜0.01，差異具有顯著性意義。說(shuō)明HIFU輻照法和反復(fù)凍融法制備的DC瘤苗都能抵抗腫瘤的生長(zhǎng)，具有主動(dòng)免疫保護(hù)作用，而且前者有優(yōu)于后者的趨勢(shì)。 結(jié)論：①聯(lián)合應(yīng)用GM-CSF和IL-4培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞，可大量擴(kuò)增成熟DC，