Notch1在人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其胞內(nèi)段真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、Notch信號是一個在進(jìn)化上高度保守的信號途徑，在脊椎動物和無脊椎動物胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。相鄰細(xì)胞通過Notch受體進(jìn)行的信號交換能夠放大和鞏固分子差異，最終決定細(xì)胞命運(yùn)。
　　Notch受體和配體均屬于I型膜蛋白，目前為止在人類發(fā)現(xiàn)了四種Notch受體（Notch1～4）以及五種相應(yīng)的配體，包括Delta-like-1、Delta-like-3、Delta-like-4、Jagged-1和Jagged-2。Notch信號

2、的激活需要結(jié)合鄰近細(xì)胞的配體。當(dāng)受體與配體結(jié)合后，受體的胞內(nèi)部分被酶切下來進(jìn)入細(xì)胞核，在細(xì)胞核內(nèi)影響大量轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。因此，Notch信號能夠正向或負(fù)向影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。
　　長期以來，Notch信號被認(rèn)為對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的許多方面具有重要的影響，包括神經(jīng)元的分化和膠質(zhì)細(xì)胞命運(yùn)決定。Notch信號能夠抑制神經(jīng)元的分化，同時直接促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化。然而，在Notch信號激活的情況下，起源于膠質(zhì)母細(xì)胞的少突膠質(zhì)母細(xì)胞不能

3、分化為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞。
　　Notch信號能夠在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)決定的重要性表明，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中可能存在Notch信號的調(diào)控異常。Purow等研究表明，Notch1及其配體Delta-like-1、Jagged-1在多個膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及人原發(fā)性膠質(zhì)瘤中呈過表達(dá)；通過RNA干擾分別下調(diào)Notch1、Delta-like-1及Jagged-1的表達(dá)，均能夠在多個膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖。與之矛盾的是，S

4、omasundaram等研究認(rèn)為，Notch信號的抑制可能是膠質(zhì)瘤進(jìn)展的重要早期事件。
　　難道Notch信號的激活實(shí)際上不利于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長嗎？要解決Notch信號的矛盾，可能有賴于對Notch信號在膠質(zhì)瘤發(fā)生和進(jìn)展過程中作用機(jī)制的進(jìn)一步理解。基于此，本課題從以下兩方面進(jìn)行了研究。
　　一、Notch1在人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義：采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測4株人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（U251、U87、BT3

5、25、SHG-44）中Notch1 mRNA的表達(dá)水平；采用免疫組化檢測15例人正常腦組織和159例人腦膠質(zhì)瘤組織中Notch1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，Notch1 mRNA在4株人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系均有表達(dá)；Notch1蛋白在星形細(xì)胞瘤及少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)陽性率和免疫反應(yīng)評分分別高于正常腦組織中的表達(dá)陽性率和免疫反應(yīng)評分（P<0.05），而Notch1蛋白在髓母細(xì)胞瘤的表達(dá)陽性率和免疫反應(yīng)評分與正常腦組織相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.0

6、5）。星形細(xì)胞瘤各病理級別之間，Notch1蛋白的表達(dá)陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤（WHOI級）和間變型星形細(xì)胞瘤（WHOIII級）Notch1蛋白的免疫反應(yīng)評分明顯高于彌漫型星形細(xì)胞瘤（WHOII級）和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（WHOIV級）（P<0.05）。少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤各病理級別之間，Notch1蛋白的表達(dá)陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤（WHOII級）Notch1蛋白的免疫反應(yīng)評分明顯高于間變型少

7、突膠質(zhì)細(xì)胞瘤（WHOIII級）（P<0.05）。結(jié)果提示，與正常腦組織相比，Notch1蛋白在星形細(xì)胞瘤和少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤中呈高表達(dá)；Notch信號可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。
　　二、人源性Notch1胞內(nèi)段真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定：通過逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）從人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞中獲得編碼NICD的cDNA，定向克隆至真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP；經(jīng)酶切和測序鑒定正確后，應(yīng)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染He