Angiopoietin-1基因真核表達載體的構建及在HEK293細胞中的表達.pdf

1、目的：構建血管生成素-1基因真核表達載體pSecTag2B-Ang-1，通過脂質體介導瞬時轉染到HEK293細胞中，并檢測其Ang-1 mRNA及蛋白表達水平，為下一步冠心病的基因治療提供實驗基礎。
　　方法：根據(jù)已知人的Ang-1 cDNA序列，設計引物。以人心臟cDNA文庫的質粒DNA為模板擴增Ang-1 cDNA，并行瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增出的目的基因通過回收、純化和酶切后與真核表達載體連接，再轉化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α

2、，并在含氨芐青霉素的培養(yǎng)皿中挑選陽性菌落，提取陽性克隆重組質粒經(jīng)酶切和基因測序進行鑒定。通過脂質體介導將構建正確的重組質粒轉染到HEK293細胞中，實驗分為兩組：轉染重組質粒的HEK293細胞作為實驗組，未轉染重組質粒的HEK293細胞作為對照組。通過實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)(Real-time Quantitative PCR Detecting System, QPCR)、蛋白質免疫印跡(Western Blot, WB)方法檢

3、測其Ang-1 mRNA及蛋白表達水平。
　　結果：成功構建血管生成素-1基因真核表達載體。將構建正確的重組質粒在脂質體介導下轉染到 HEK293細胞中，經(jīng) QPCR方法檢測示實驗組較對照組中Ang-1mRNA的表達水平明顯升高（p<0.05）。Western Blot方法檢測示實驗組較對照組中Ang-1蛋白表達水平顯著性增高（p<0.05）。本實驗結果顯示轉染重組質粒的HEK293細胞能高效并穩(wěn)定地表達Ang-1 mRNA和蛋白