免疫性血小板減少性紫癜患者外周血CD4+T細(xì)胞亞群數(shù)量及功能研究.pdf

1、研究背景:免疫性血小板減少性紫癜(Immune Thrombocytopenic purpura, ITP)是一種獲得性器官特異性自身免疫性疾病。患者體內(nèi)產(chǎn)生抗血小板自身抗體，導(dǎo)致網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)破壞吞噬血小板，從而引起血小板減少。依據(jù)ITP發(fā)病持續(xù)時間，可以分為新診斷的，持續(xù)性和慢性ITP。自上世紀(jì)50年代以來，研究人員對ITP的發(fā)病機制進(jìn)行了大量的研究。特別是近年來隨著免疫學(xué)的發(fā)展，人們對其發(fā)病機理的認(rèn)識有了很大的提高，經(jīng)典機制認(rèn)為IT

2、P的發(fā)病是由自身抗體介導(dǎo)的，但細(xì)胞免疫在ITP發(fā)病中亦起著重要作用。對于ITP患者T細(xì)胞的異常已有報道，包括血小板特異的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化，增強的針對血小板的細(xì)胞毒作用，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的缺失等。本文探討ITP患者中T輔助細(xì)胞CD4+(helper T cell，Th)細(xì)胞免疫狀態(tài)以及其與治療反應(yīng)的關(guān)系，檢測ITP患者CD4+細(xì)胞中Th1/Th2/Th17/Treg細(xì)胞亞群的比例及其分泌的細(xì)胞因子情況，并研究它們隨疾病不同狀態(tài)的變化，進(jìn)

3、一步清楚了解T細(xì)胞在ITP發(fā)病中的作用，為ITP患者的治療提供新的理論依據(jù)。蛋白芯片是一種高通量監(jiān)測系統(tǒng)，通過靶分子和捕捉分子相互作用來監(jiān)測蛋白分子之間的相互作用。蛋白芯片能夠同時檢測多種細(xì)胞因子，有助于闡明細(xì)胞因子在ITP發(fā)病中的作用，為靶向治療提供理論依據(jù)。
　　目的:檢測ITP患者糖皮質(zhì)激素治療前后體內(nèi)CD4+細(xì)胞比例以及CD4+細(xì)胞Th1/Th2/Th17/Treg細(xì)胞亞群相關(guān)細(xì)胞因子及其轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，研究ITP患者CD

4、4+細(xì)胞亞群分布特點及與臨床的關(guān)系。
　　檢測ITP患者外周血中40種與CD4+細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子的變化，旨在利用蛋白芯片技術(shù)觀察這40種細(xì)胞因子在疾病的不同時期的表達(dá)，了解與ITP疾病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞因子。
　　方法:應(yīng)用流式細(xì)胞計數(shù)方法檢測ITP患者外周血CD4+細(xì)胞百分率、CD8+細(xì)胞百分率、CD4+/CD8+細(xì)胞比值，并分析它們與ITP患者外周血血小板的相關(guān)性。應(yīng)用流式細(xì)胞計數(shù)方法檢測實時熒光定量RT-PCR方法檢測了

5、20例初發(fā)ITP患者（男性8例，女性12例，中位年齡41.0yrs）外周血單個核細(xì)胞CD4+細(xì)胞Th1/Th2/Th17/Treg細(xì)胞亞群相關(guān)細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子T-bet, IFN-γ，GATA-3，TGF-β，F(xiàn)oxp3，IL-2，IL-4等的表達(dá)，并檢測了患者接受糖皮質(zhì)激素治療后以及20例正常對照者外周血單個核細(xì)胞中T-bet，IFN-γ，GATA-3，TGF-β，F(xiàn)oxp3，IL-2，IL-4基因表達(dá)水平。
　　同時應(yīng)用Ra

6、yBio(R)Human Inflammation Antibody Array3細(xì)胞因子抗體芯片盒檢測ITP患者的外周血中40種細(xì)胞因子變化。蛋白芯片技術(shù)檢測了30例初發(fā)患者、30例完全緩解患者的血漿中Th1/Th2/Th17/Treg細(xì)胞相關(guān)的40種細(xì)胞因子蛋白的表達(dá)情況，并分析這些細(xì)胞因子與患者病情的相關(guān)性。
　　結(jié)果:實時熒光檢測中所有ITP患者均能完成糖皮質(zhì)激素治療，未發(fā)生明顯治療不良反應(yīng)，治療前血小板計數(shù)為(17.6±

7、13.8)×109/L，治療后血小板計數(shù)達(dá)到(123.8±52.8)×109/L，其中12例取得完全緩解（血小板計數(shù)≥100×109/L），7例取得部分緩解（血小板計數(shù)≥50×109/L），1例治療后血小板計數(shù)僅達(dá)到45×109/L，但出血癥狀明顯改善。治療前患者外周血單個核細(xì)胞中T-bet、IFN-γ、IL-2表達(dá)均較正常對照明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01);治療后Foxp3表達(dá)較治療前升高(p＜0.05)，T-bet、

8、IFN-γ、IL-2、IL-4表達(dá)均較治療前降低(p＜0.05)，其中IL-2表達(dá)仍較正常對照升高(p＜0.01)。
　　Th1細(xì)胞相關(guān)基因(T-bet、IFN-γ、IL-2)中，T-bet、IFN-γ在各亞組中治療后表達(dá)水平均較治療前降低(p＜0.05)，IL-2在各亞組中治療后表達(dá)水平亦較治療前降低，但在治療前血小板計數(shù)≤10×109/L及治療后血小板計數(shù)≤100×109/L患者中治療前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Th2細(xì)胞相關(guān)基因（

9、GATA-3、IL-4）在各亞組中治療前后差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。Treg細(xì)胞相關(guān)基因(Foxp3、TGF-β)中，F(xiàn)oxp3在治療前血小板計數(shù)≤10×109/L患者中治療后表達(dá)水平較治療前明顯升高(p＜0.05); TGF-β在老年患者與年輕患者中呈現(xiàn)截然相反的變化模式，其在年齡＜60yrs患者中治療后表達(dá)水平較治療前降低(p＜0.05)，而在年齡≥60yrs患者中治療后表達(dá)水平較治療前升高(p＞0.05)。
　　細(xì)胞因子蛋白芯片實

10、驗發(fā)現(xiàn)，與正常健康人相比，初發(fā)ITP患者升高2倍以上的細(xì)胞因子有:EOTAXIN，EOTAXIN-2，GM-CSF, G-CSF, IFN-γ，IL-1β，IL-2，IL-4, IL-6, IL-7, IL-11, IL-12p40, IP-10, MCP-1, M-CSF, RANTES, PDGF-B;而細(xì)胞因子Ⅰ-309, IL-1α, IL-3, IL-6sR,IL-8,IL-10,IL-12p70,IL-13,IL-15,IL

11、-16, MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-1δ, TGF-β1, TNF-α, TNF-β, sTNFRI,TIMP-2與正常對照組相比變化在2倍以內(nèi);降低2倍以上的細(xì)胞因子有ICAM-1, IL-17,s TNFRⅡ, MCP-2。
　　ITP患者緩解時，EOTAXIN，EOTAXIN-2，IFN-γ，IL-1β，IL-2，IL-6，IL-11，IL-12p40，IL-7，IP-10，MCP-1這些在患者初發(fā)時

12、升高2倍以上的因子恢復(fù)到正常水平，與正常組相比變化在2倍以內(nèi)。緩解時仍然升高2倍以上的細(xì)胞因子有:RANTES，G-CSF, PDGF-B，GM-CSF, M-CSF, IL-4，而ICAM-1，IL-8在初發(fā)時未見升高而緩解時升高2倍。
　　結(jié)論:ITP患者存在Th細(xì)胞功能異常，Th1/Th2/Th17/Treg細(xì)胞亞群的比例失衡。糖皮質(zhì)激素治療仍是針對初治ITP患者的有效治療手段，其作用機制可能與抑制Th1、Th2細(xì)胞亞群（以