高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細胞hNaDC3表達變化及其信號傳導(dǎo)的研究.pdf

1、背景和目的： 腎小球疾病多伴有腎小管間質(zhì)損害，腎小管間質(zhì)纖維化是各種腎病發(fā)展到終末期階段的共同通路。研究表明在各種病理情況下，腎小管上皮細胞可以轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞，而腎小管上皮細胞能量代謝障礙可能是腎小管損害發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。 正常情況下，腎小管上皮細胞是一種極性上皮細胞，其管腔側(cè)膜(頂膜)及基底側(cè)膜的結(jié)構(gòu)、功能及組成成分(蛋白質(zhì)及脂質(zhì))明顯不同。這種極性特征的建立與維持對于腎小管上皮發(fā)揮選擇性重吸收及分泌功能是至關(guān)

2、重要的。各種病理因素如高糖、凝血纖溶紊亂、缺血缺氧、能量代謝紊亂可能導(dǎo)致腎小管上皮細胞損傷，能量代謝障礙，使ATP合成不足，有可能導(dǎo)致細胞骨架解離、細胞極性消失，腎小管上皮失去選擇性重吸收功能。 二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白是一類負責三羧酸循環(huán)中間.產(chǎn)物轉(zhuǎn)運及重吸收的有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白家族。鈉/二羧酸轉(zhuǎn)運蛋白3(NaDC3)負責從細胞外液、血液中轉(zhuǎn)運三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物到細胞內(nèi)，位于腎小管基底側(cè)，呈極性分布，由于NaDC3在腎小管能量代謝中具有

3、重要作用，故我們推測各種病理因素有可能通過影響其表達及結(jié)構(gòu)或極性分布狀態(tài)，從而導(dǎo)致腎小管上皮發(fā)生能量代謝障礙，可能在腎小管間質(zhì)損傷的發(fā)生中起重要作用。 根據(jù)以往對糖尿病的研究，蛋白激酶C(PKC)是開啟細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵酶；絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)信號通路可被以下各種刺激激活：高糖本身、高糖誘發(fā)的山梨醇應(yīng)激、蛋白激酶C(PKC)亞型的激活及糖基化終產(chǎn)物(AGE)等。 本實驗觀察在高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細胞(HKC

4、)NaDC3的表達及細胞能量代謝變化及其轉(zhuǎn)分化的作用，并探討其信號傳導(dǎo)通路。 實驗方法： 1.用蛋白A和GST柱純化兔抗hNaDC3多克隆抗體(實驗室自制)，western及免疫組化鑒定抗體的特異性。 2.以不同葡萄糖濃度和時間刺激HKC細胞，甘露醇為滲透壓對照，North及Western檢測HKC細胞hNaDC3的mRNA和蛋白表達隨高糖濃度及時間變化，同時檢測細胞ATP濃度、H2O3的生成及JC-1為探針激光

5、共聚焦檢測細胞線粒體膜電位改變，了解能量代謝變化。 3.葡萄糖糖不同濃度刺激HKC細胞，檢測erk的蛋白表達改變。以MAPK及PKC阻斷劑。PD98059，SB203580，Chelerythrine干預(yù)葡萄糖的作用，檢測hNaDC3的表達變化。 4.5.5、25mM葡萄糖長期培養(yǎng)HKC，檢測hNaDC3、a-SMA表達變化，細胞免疫熒光觀察細胞a-SMA，Vimentin的表達。以脂質(zhì)體Lipofect將pGFP-hN

6、aDC3轉(zhuǎn)染至具有上皮細胞極性的LLC-PK1，激光共聚焦觀察高糖刺激下細胞極性改變。 實驗結(jié)果： 1.抗體純化后特異結(jié)合hNaDC3蛋白，定位于人腎近端小管基底側(cè)。North及Western結(jié)果顯示：HKC細胞hNaDC3隨高糖濃度表達增加，呈時間、劑量依賴性，于葡萄糖濃度25mM48hr達高峰。同時其ATP濃度明顯升高、H2O3的生成增加。25mM葡萄糖濃度24hr細胞線粒體膜電位明顯高于對照組。 2.高糖刺

7、激可使HKC細胞p-erk表達上調(diào)，erk的活性與hNaDC3高表達明顯相關(guān)；erk特異性阻斷劑PD98059，PKC阻斷劑Chelerythrine可抑制高糖引起的HKC高表達hNaDC3，而p38特異性阻斷劑SB203580無阻斷作用。 3.長期高糖培養(yǎng)HKC，western檢測hNa，DC3蛋白表達較正常組明顯下調(diào)，而a-SMA蛋白表達上調(diào)；同時細胞免疫熒光結(jié)果顯示HKC細胞表達Vimetltin增強，并出現(xiàn)a-SMA表達

8、。激光共聚焦觀察高糖刺激下轉(zhuǎn)染pGFP-hNaDC3的LLC-PKl細胞，24hrpGFP-hNaDC3熒光分布呈非極性改變，頂膜及基底膜均有表達，48hr熒光明顯減弱。 結(jié)論： 高糖刺激HKC短期內(nèi)誘導(dǎo)hNaDC3高表達，呈時間、劑量依賴性，同時高糖刺激使細胞代謝明顯增強。并通過erk活化及PKC信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。長期高糖刺激HKChNaDC3表達下調(diào)，hNaDC3非極性分布；同時出現(xiàn)間皮細胞標志Vimentin及肌動蛋白