Sonic Hedgehog信號通路對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡及白藜蘆醇干預(yù)作用研究.pdf

1、目的:隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，我國民眾的生活方式有了極大的變化，糖尿病發(fā)病率逐年升高。最新研究結(jié)果顯示我國總體糖尿病患病率已達(dá)9.7％，其中6.5％～42％的患者伴有腎臟病。而糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)作為糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，已成為我國引發(fā)終末期腎衰竭的第二位病因?；颊咭坏┻M(jìn)入終末期腎衰竭，將不得不依靠血液透析、腹膜透析或腎移植來維持生命，給國家和個人帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。因此如何有效防治糖尿病腎病是廣

2、大腎臟病學(xué)者面臨的挑戰(zhàn)，也是研究的熱點問題。
　　 既往有關(guān)糖尿病腎病的研究多集中于腎小球病變，但晚近研究表明糖尿病所致腎小管間質(zhì)病變也是糖尿病腎臟病變的重要病理基礎(chǔ)，與糖尿病腎病的進(jìn)展和腎功能損害密切相關(guān)。大量研究證實，糖尿病腎小管損傷包括腎小管上皮細(xì)胞高轉(zhuǎn)運、細(xì)胞的肥大以及凋亡等。細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致腎小管回吸收和排秘功能失調(diào)，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞萎縮和腎間質(zhì)纖維化。因此深入了解高糖導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的機制，對探究糖尿病患者腎

3、功能的保護(hù)具有重要意義。
　　 哺乳動物體內(nèi)有3中同源Hh基因，為Sonic hedgehog(SHH)，Indian hedgehog(IHH)和Desert hedgehog(DHH)，分別編碼相應(yīng)的蛋白，與器官的形成、組織的發(fā)育、細(xì)胞的分化和增殖以及損傷后的修復(fù)密切相關(guān)，并在腫瘤的發(fā)生、組織的纖維化等過程中也發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注腎損傷中，Shh信號通路與腎功能損害密切相關(guān)，并且該信號通路可以誘導(dǎo)梗阻性腎病大

4、鼠腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。提示Hh信號通路不僅在控制胚胎發(fā)育，而且在胚胎發(fā)育完成后依然調(diào)控著細(xì)胞的生長、增殖和分化過程，參與了體內(nèi)多種生物學(xué)行為。
　　 雖然對糖尿病并發(fā)癥的研究越來越深入，但是尚無防治糖尿病腎病的有效手段。目前主要是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和/或血管緊張素受體拮抗劑的應(yīng)用，以及控制血糖、調(diào)整向脂等綜合治療。白藜蘆醇(Resveratrol)化學(xué)名稱為芪三酚，廣泛存在于葡萄科、百合科、寥科等70種植物中，在我國的傳統(tǒng)

5、中藥虎杖和何首烏等中也發(fā)現(xiàn)有其存在。該藥具有抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)脂代謝、抗菌、抗癌、抗衰老等作用，能夠通過抗氧化應(yīng)激保護(hù)db/db鼠的腎臟。體外實驗也表明白藜蘆醇能抑制腎臟系膜細(xì)胞的增殖，影響細(xì)胞周期的分布，但其對糖尿病腎病腎臟保護(hù)的確切機制仍不明確。
　　 本研究擬通過臨床觀察、細(xì)胞培養(yǎng)和動物實驗，全面分析Shh及其信號通路相關(guān)蛋白Ptch(Patched)、Smo(Smoothened)、Gli2(Glioma-associ

6、ated oncogenes 2)在高糖狀態(tài)下腎組織中的表達(dá)變化，以及該信號通路與腎小管上皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系。利用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，測定在體外干擾高糖環(huán)境培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞系(HK-2細(xì)胞)轉(zhuǎn)錄合成Shh后，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡的情況。并給予含有重組Shh蛋白的培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，進(jìn)一步明確Shh信號通路在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的作用。通過對STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠和高糖環(huán)境中培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞給予白藜蘆醇進(jìn)行干預(yù)，從轉(zhuǎn)錄和分子水平

7、觀察白藜蘆醇對Shh信號通路的影響及其發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的可能途徑，為進(jìn)一步闡明糖尿病狀態(tài)下腎小管上皮細(xì)胞凋亡發(fā)生的分子學(xué)機制及防治提供實驗性依據(jù)。
　　 方法:
　　 第一部分:從我院腎內(nèi)科2010年6月至2012年6月住院患者中選擇符合1999年WHO2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)腎活檢病理檢查確診為糖尿病腎病的12例患者為研究對象，另外5例正常腎組織（選自我院泌尿外科腎癌患者手術(shù)切除的腎臟病灶遠(yuǎn)周部分）作為正常對照組，進(jìn)行免

8、疫組織化學(xué)染色，半定量分析各組腎組織標(biāo)本中Shh信號通路相關(guān)蛋白Shh、Ptch1、Smo、Gli2的表達(dá);TUNEL檢測腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。
　　 第二部分:體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞系(HK-2細(xì)胞)，分為3組，低糖組、高糖組和甘露醇組。同步化12小時后給予相應(yīng)的刺激，于刺激后12h、24h、48h、72h，消化收集各組細(xì)胞，75％乙醇固定，送流式檢測凋亡細(xì)胞百分比。
　　 體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞，以細(xì)胞凋亡最明顯的

9、時間為干預(yù)時間，以低糖和高糖組為對照，分別應(yīng)用重組人Shh蛋白、白藜蘆醇干預(yù)或者進(jìn)行ShhsiRNA轉(zhuǎn)染，同步化12小時后給予相應(yīng)的刺激，屆時收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白、總RNA，應(yīng)用western blot測定各組細(xì)胞Shh、Ptch1、Smo、Gli2、p53、Bax和cleaved caspase 3蛋白的表達(dá)，real time PCR檢測Shh、Gli2mRNA的表達(dá)。同時消化離心細(xì)胞，75％乙醇固定，送流式檢測凋亡細(xì)胞百分

10、比。另外鋪六孔板，共聚焦顯微鏡檢測Shh、Ptch1、Smo、Gli2在細(xì)胞中的表達(dá)，TUNEL觀察細(xì)胞凋亡情況。
　　 第三部分:建立單側(cè)腎切除+鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的CD-1小鼠(體重20g±2g)1型糖尿病模型，設(shè)立單純單側(cè)腎切除組(對照組，n=24)、單側(cè)腎切除+糖尿病組(模型組，n=24)，單側(cè)腎切除+糖尿病+白藜蘆醇干預(yù)組(干預(yù)組，n=24)實驗共24周，分別于第8、12和24周末收集各組小鼠血、尿和腎組織標(biāo)本，測定血糖(

11、blood glucose，BG)、血肌酐(serum creatinine，Scr)、血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、尿蛋白(urinaryprotein，UP)，并計算腎重/體重比值(kidney weight/body weight ratio，KW/BW)。腎組織行蘇木素-伊紅(ematoxylin-eosin，HE)染色和過碘酸-希夫(periodic ac

12、id-schiff,PAS)染色，普通光鏡下觀察腎組織病理學(xué)改變。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測腎組織Shh、Ptch1、Smo、Gli2的表達(dá);western blot檢測Shh、Ptch1、Smo、Gli2以及凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax、cleaved caspase3的表達(dá);real time PCR測定腎組織Shh、Gli2mRNA的表達(dá);TUNAL觀察腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:正常腎組織中

13、有Shh、Ptch1、Smo及Gli2的表達(dá)，以腎小管為主，腎小球幾乎無表達(dá)。在糖尿病腎病患者腎組織切片中，上述4種蛋白表達(dá)較正常組減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）。腎組織石蠟切片TUNEL檢測，糖尿病腎病組腎小管上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）。
　　 第二部分:在高糖刺激48小時，HK-2細(xì)胞凋亡達(dá)高峰，凋亡細(xì)胞百分比較其他3個時間點，即12h、24h、72h明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

14、p＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示，48小時高糖組Shh、Ptch1、Smo和Gli2蛋白表達(dá)均較低糖組、甘露醇組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);p53、Bax、cleaved caspase3表達(dá)則明顯高于低糖組和甘露醇組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）;高糖組Shh、Gli2mRNA表達(dá)也明顯下降，低于低糖組和甘露醇組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）。
　　 HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染ShhsiRNA后培

15、養(yǎng)48h，高糖轉(zhuǎn)染ShhsiRNA組(HG+siShh組)細(xì)胞凋亡率最高，與低糖組、高糖組、高糖轉(zhuǎn)染無關(guān)對照組(HG+siCon組)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）;Shh、Ptch1、Smo和Gli2表達(dá)較其他各組降低，p53、Bax、cleaved caspase 3表達(dá)較其他各組升高明顯，Shh、Gli2mRNA表達(dá)低于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。高糖組和HG+siCon組之間上述各指標(biāo)無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(p＞

16、0.05)。
　　 高糖培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞加入重組人Shh蛋白刺激48h后，細(xì)胞凋亡發(fā)生率較高糖組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);Shh、Ptch1、Smo和Gli2表達(dá)較高糖組升高，p53、Bax、cleavedcaspase3表達(dá)明顯低于高糖組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）;Gli2mRNA表達(dá)也明顯高于高糖組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）。
　　 對HK-2細(xì)胞給予高糖聯(lián)合白藜蘆醇刺激48h，細(xì)

17、胞凋亡較高糖組減少，p53、Bax、cleavedcaspase3表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);Shh、Ptch1、Smo、Gli2及Shh、Gli2mRNA表達(dá)也明顯上調(diào)，高于高糖組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）。
　　 第三部分:小鼠注射STZ后3天左右即出現(xiàn)多飲、多食、多尿等糖尿病癥狀;第8周末，模型組小鼠腎小管間質(zhì)有少量淋巴單核細(xì)胞浸潤。隨著病程進(jìn)展，12周末和24周末小鼠腎組織病變加重，小管間質(zhì)淋

18、巴單核細(xì)胞浸潤增多，小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)絨毛脫落，小管擴張，腎小球系膜區(qū)增寬等，而對照組無明顯病變，干預(yù)組病變介于對照組和模型組之間。與對照組相比，模型組和干預(yù)組小鼠在8周、12周，24周末時血糖明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）;但三組小鼠血膽固醇和甘油三酯無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05）;12周、24周末時，模型組和干預(yù)組出現(xiàn)腎重/體重比增加，以及血肌酐和蛋白尿的升高，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。自12周末起，模

19、型組小鼠腎組織勻漿Shh、Ptch1、Smo、Gli2表達(dá)下降，Shh、Gli2mRNA表達(dá)減弱，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);自8周末起，模型組小鼠腎組織勻漿p53、Bax、cleavedcaspase3表達(dá)明顯增強，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）;干預(yù)組上述指標(biāo)介于對照組和模型組之間，三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）。TUNEL結(jié)果證實，模型組在12周、24周末腎小管上皮細(xì)胞凋亡數(shù)目增加，干預(yù)

20、組細(xì)胞凋亡減少，但仍多于對照組，三組間結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1、本研究結(jié)果顯示，Shh在成年人或小鼠腎臟內(nèi)有基礎(chǔ)表達(dá)，主要分布于腎小管上皮細(xì)胞。但在糖尿病腎病狀態(tài)下Shh及其信號通路相關(guān)蛋白Ptch1、Smo、Gli2在腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)明顯減弱。
　　 2、體外實驗證實，以siRNA干擾HK-2細(xì)胞中Shh基因的合成能夠抑制Shh信號的傳遞，抑制核轉(zhuǎn)錄因子Gli2的表達(dá)，

21、從而使其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)減弱，進(jìn)一步上調(diào)凋亡相關(guān)基因p53、Bax的表達(dá)，誘導(dǎo)caspase3的活化，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，提示Shh信號通路參與了高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，此過程與凋亡基因的p53、Bax有關(guān)。
　　 3、在體外給予重組Shh刺激HK-2細(xì)胞后，可明顯活化Shh信號通路，促進(jìn)Gli2基因及其蛋白的表達(dá)，抑制凋亡相關(guān)基因p53、Bax的表達(dá)，干擾caspase3的活化，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。提示上調(diào)S