基因組重測序基礎上的早實枳與普通枳部分差異基因比較分析.pdf

1、柑橘是世界范圍內(nèi)栽培最多的果樹之一，其生長發(fā)育需要經(jīng)過漫長的童期，極大地阻礙了柑橘早豐產(chǎn)的獲取和遺傳育種的研究。早實枳是普通枳的早花變異，兩者之間除了開花習性不同外，其他特征幾乎完全一樣，前人的研究發(fā)現(xiàn)兩者有相近的遺傳背景，因此它也是研究柑橘成花發(fā)育的絕佳材料。本實驗室對早實枳與普通枳進行了基因組重測序，參考克里曼丁橘全基因組數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學的方法對重測序數(shù)據(jù)進行了分析，得到了較多早實枳與普通枳存在差異的序列信息。本研究主要通過實

2、驗方法，采用PCR擴增和克隆測序對早實枳與普通枳之間的候選InDel進行驗證，并對篩選出來的重點基因進行結構與功能分析。主要研究結果如下:
　　1.對存在于CDS區(qū)域的InDel進行分級。以克里曼丁橘基因組為參考，共設計引物97對，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳、AT克隆測序的方法對InDel進行驗證;
　　2.共有83對引物在PAGE膠中有清晰的條帶。其中有12對顯示早實枳與普通枳條帶之間有差異，占總結果的14.5％，反映出基因組

3、重測序及分析準確率較低;有40對顯示早實枳與普通枳無差異，但與克里曼丁橘之間有差異，占總結果的48.2％，說明了枳與橘之間客觀存在的遺傳差異，可為它們之間開發(fā)分子標記提供借鑒;
　　3.通過AT克隆測序驗證了12個早實枳與普通枳存在InDel的差異序列，基因編號為:Pt-21（未知基因）、Pt-35（PP2C型蛋白磷酸酶）、Pt-49(RHC2A型環(huán)指)、Pt-74（抗病蛋白）、Pt-75（抗病蛋白）、Pt-77（類RLP1受體基

4、因）、Pt-81（甲基脂酶）、Pt-83（CCCH鋅指家族）、Pt-84(NAD+，氧化還原酶)、Pt-86(MBD1，甲基化CpG結合域蛋白1)、Pt-87（未知基因）、Pt-88（未知基因）;
　　4.對3個重點差異基因進行表達分析。3個基因分別命名為PtAGO5、PtRZF和PtCCCHZF，以春梢和夏梢自剪前、中、后期頂芽為材料，進行RT-PCR實驗。發(fā)現(xiàn)PtRZF和PtCCCHZF在春梢和夏梢的自剪前、中、后期表達量逐漸

5、上升，且在早實枳與普通枳中表達模式類似，表明這兩個基因可能參與了柑橘成花轉變過程;PtAGO5基因在春梢中的表達模式與其他兩個基因類似，但是在夏梢自剪過程中表現(xiàn)出了不一樣的表達模式，可能與該基因的特異性功能有關;
　　5.對3個重點差異基因進行轉基因功能驗證。分別以早實枳和普通枳為模板構建了6個超表達載體，并轉化煙草觀察其表型差異?，F(xiàn)已得到分別來自早實枳和普通枳的PtAGO5基因的轉基因煙草T0代植株，但是目前尚未觀察到兩者之間有