FLC途徑幾個(gè)關(guān)鍵基因及miRNAs在早實(shí)枳階段發(fā)育中的作用機(jī)制研究.pdf

1、適時(shí)完成由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變是開花植物成功進(jìn)行生殖和繁衍后代的關(guān)鍵，也是植物整個(gè)生命周期的中心環(huán)節(jié)。柑橘是目前世界范圍廣泛種植的經(jīng)濟(jì)果樹之一，由于大多數(shù)柑橘種類童期較長(zhǎng)，再加上遺傳上高度雜合，使得傳統(tǒng)的柑橘育種進(jìn)展緩慢。因此，從分子水平上揭示柑橘成花發(fā)育的內(nèi)在機(jī)制，對(duì)于縮短柑橘童期、提高育種效率和改善重要農(nóng)藝性狀具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。MADS-box基因及miRNAs在植物的生殖發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本研究以早實(shí)

2、枳為材料，跟蹤模式植物成花發(fā)育前沿進(jìn)展，對(duì)柑橘中MADS-box家族FLC途徑的幾個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子的功能及成花發(fā)育相關(guān)miRNAs的表達(dá)特征進(jìn)行了分析，以期為進(jìn)一步豐富木本植物成花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、利用這些基因進(jìn)行柑橘遺傳改良提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1、PtFLC轉(zhuǎn)錄本的功能及作用機(jī)制。在已發(fā)現(xiàn)早實(shí)枳PtFLC基因存在選擇性剪切的基礎(chǔ)上，首先分離了PtFLC各轉(zhuǎn)錄本和基因組全長(zhǎng)，并對(duì)它們的結(jié)構(gòu)和序列特征進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該基因具

3、有一個(gè)相當(dāng)長(zhǎng)的第一個(gè)內(nèi)含子;不同轉(zhuǎn)錄本編碼序列不同，并且轉(zhuǎn)錄活性也存在一定差異，其中PtFLCV3和PtFLCV5轉(zhuǎn)錄活性較強(qiáng);轉(zhuǎn)基因擬南芥成花統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，不同轉(zhuǎn)錄本抑制成花的能力有所不同，且與它們的轉(zhuǎn)錄活性具有一定相關(guān)性;通過酵母雙雜文庫(kù)篩選，不同轉(zhuǎn)錄本篩選得到了不同的互作蛋白，進(jìn)一步的兩兩共轉(zhuǎn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，這些蛋白與不同轉(zhuǎn)錄本的互作既具有一定的共性又有一定的特異性，如PtNAD(P)蛋白與各轉(zhuǎn)錄本都能互作。
　　采用染色體步移分

4、離了PtFLC基因的啟動(dòng)子，并在其序列中預(yù)測(cè)到多種順式調(diào)控元件;通過利用酵母單雜交對(duì)PtFLC啟動(dòng)子結(jié)合蛋白進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)種子休眠解除相關(guān)蛋白等能夠與該序列直接互作，表明該基因可能在種子的萌發(fā)及生殖發(fā)育過程也有一定作用;為進(jìn)一步了解PtFLC的表達(dá)特點(diǎn)，構(gòu)建了PtFLC∷GUS融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入擬南芥，在轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)的早期就能檢測(cè)到GUS活性，并貫穿植株整個(gè)發(fā)育階段;PtFLC啟動(dòng)子在地上各組織均有表達(dá)，且在生殖過程中發(fā)揮一定作

5、用;該啟動(dòng)子活性能夠被低溫所抑制，但脫離低溫后其活性又得以恢復(fù)。
　　2、早實(shí)枳APETALA1基因序列特征及功能分析。APETALA1是植物成花轉(zhuǎn)變的標(biāo)志性基因。本研究通過同源克隆分離了早實(shí)枳PtAP1cDNA序列，序列比對(duì)及進(jìn)化分析表明PtAP1屬于euAP1分支;與擬南芥AP1有所不同的是，PtAP1除了在各生殖組織中均有表達(dá)外，在營(yíng)養(yǎng)器官中也有微弱表達(dá)，而且它的表達(dá)還隨著新梢自剪和成花能力的變化呈現(xiàn)一定波動(dòng)性;PtAP1在

6、擬南芥中的異位表達(dá)引起轉(zhuǎn)基因植株的早花和形態(tài)的改變，并且它在成花時(shí)間上部分互補(bǔ)ap1-1突變體的表型，表明其在成花時(shí)間調(diào)控上的功能保守性。
　　為進(jìn)一步了解PtAP1的調(diào)控作用，我們克隆了PtAP1基因上游1000bp的啟動(dòng)子序列，在線軟件分析表明其序列上存在各種順式調(diào)控元件;PtAP1∷GUS融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥結(jié)果顯示，PtAP1啟動(dòng)子在擬南芥各發(fā)育時(shí)期都有一定活性，且表現(xiàn)出一定的時(shí)期和組織的特異性;通過對(duì)PtAP1啟動(dòng)子構(gòu)

7、建酵母單雜交報(bào)告載體并進(jìn)行文庫(kù)篩選，獲得了直接作用于該序列的蛋白，如參與脅迫或激素調(diào)控的早光誘導(dǎo)蛋白(ELIP)、赤霉素調(diào)節(jié)蛋白等。
　　3、PtAGL24基因的表達(dá)分析與功能鑒定。結(jié)合RACE克隆技術(shù)分離了早實(shí)枳中AGL24的同源基因PtAGL24，通過與其基因組序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因包含有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，其氨基酸序列與楊樹的PtrMADS9同源性較高，達(dá)79％;進(jìn)化分析表明PtAGL24與其它物種中AGL24的同源基因聚在

8、一起，但與擬南芥AGL24有所分離;PtAGL24在早實(shí)枳各組織中都有表達(dá)，在成熟的花器官中相對(duì)高一些;PtAGL24蛋白主要定位于細(xì)胞核中。
　　通過對(duì)35∷PtAGL24轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系根據(jù)其花器官形態(tài)特征可分為兩類，Ⅰ類轉(zhuǎn)基因株系中PtAGL24的表達(dá)較高，該類植株不僅表現(xiàn)為早花，而且在葉片及生殖器官的形態(tài)上也發(fā)生了改變，Ⅱ類轉(zhuǎn)基因株系在生殖組織的形態(tài)上則與野生型相似;PtAGL24能夠與擬南芥中內(nèi)源的

9、AGL24及AGL24的互作蛋白發(fā)生互作，這種外源與內(nèi)源蛋白不適當(dāng)?shù)幕プ骺赡軐?dǎo)致了轉(zhuǎn)基因植株表型的異常;PtAGL24的啟動(dòng)子在胚根突破種皮時(shí)開始表達(dá)，并且在幼苗期活性較強(qiáng)一些，同樣受環(huán)境低溫的誘導(dǎo)。
　　4、早實(shí)枳及普通枳發(fā)育相關(guān)miRNAs的比較分析。構(gòu)建了早實(shí)枳及普通枳不同發(fā)育階段的小RNA文庫(kù)，并分別進(jìn)行了Solexa測(cè)序，從四個(gè)文庫(kù)中獲得了141條已知的miRNAs和75條新穎的miRNAs;通過進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)成年階