FLC途徑幾個關鍵基因及miRNAs在早實枳階段發(fā)育中的作用機制研究.pdf

1、適時完成由營養(yǎng)生長向生殖生長的轉變是開花植物成功進行生殖和繁衍后代的關鍵，也是植物整個生命周期的中心環(huán)節(jié)。柑橘是目前世界范圍廣泛種植的經濟果樹之一，由于大多數柑橘種類童期較長，再加上遺傳上高度雜合，使得傳統(tǒng)的柑橘育種進展緩慢。因此，從分子水平上揭示柑橘成花發(fā)育的內在機制，對于縮短柑橘童期、提高育種效率和改善重要農藝性狀具有重要的理論意義和實踐價值。MADS-box基因及miRNAs在植物的生殖發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調控作用。本研究以早實

2、枳為材料，跟蹤模式植物成花發(fā)育前沿進展，對柑橘中MADS-box家族FLC途徑的幾個關鍵調控因子的功能及成花發(fā)育相關miRNAs的表達特征進行了分析，以期為進一步豐富木本植物成花調控網絡、利用這些基因進行柑橘遺傳改良提供理論依據。主要研究結果如下:
　　1、PtFLC轉錄本的功能及作用機制。在已發(fā)現早實枳PtFLC基因存在選擇性剪切的基礎上，首先分離了PtFLC各轉錄本和基因組全長，并對它們的結構和序列特征進行了分析，發(fā)現該基因具

3、有一個相當長的第一個內含子;不同轉錄本編碼序列不同，并且轉錄活性也存在一定差異，其中PtFLCV3和PtFLCV5轉錄活性較強;轉基因擬南芥成花統(tǒng)計結果表明，不同轉錄本抑制成花的能力有所不同，且與它們的轉錄活性具有一定相關性;通過酵母雙雜文庫篩選，不同轉錄本篩選得到了不同的互作蛋白，進一步的兩兩共轉驗證發(fā)現，這些蛋白與不同轉錄本的互作既具有一定的共性又有一定的特異性，如PtNAD(P)蛋白與各轉錄本都能互作。
　　采用染色體步移分

4、離了PtFLC基因的啟動子，并在其序列中預測到多種順式調控元件;通過利用酵母單雜交對PtFLC啟動子結合蛋白進行鑒定，發(fā)現種子休眠解除相關蛋白等能夠與該序列直接互作，表明該基因可能在種子的萌發(fā)及生殖發(fā)育過程也有一定作用;為進一步了解PtFLC的表達特點，構建了PtFLC∷GUS融合表達載體并轉入擬南芥，在轉基因擬南芥種子萌發(fā)的早期就能檢測到GUS活性，并貫穿植株整個發(fā)育階段;PtFLC啟動子在地上各組織均有表達，且在生殖過程中發(fā)揮一定作

5、用;該啟動子活性能夠被低溫所抑制，但脫離低溫后其活性又得以恢復。
　　2、早實枳APETALA1基因序列特征及功能分析。APETALA1是植物成花轉變的標志性基因。本研究通過同源克隆分離了早實枳PtAP1cDNA序列，序列比對及進化分析表明PtAP1屬于euAP1分支;與擬南芥AP1有所不同的是，PtAP1除了在各生殖組織中均有表達外，在營養(yǎng)器官中也有微弱表達，而且它的表達還隨著新梢自剪和成花能力的變化呈現一定波動性;PtAP1在

6、擬南芥中的異位表達引起轉基因植株的早花和形態(tài)的改變，并且它在成花時間上部分互補ap1-1突變體的表型，表明其在成花時間調控上的功能保守性。
　　為進一步了解PtAP1的調控作用，我們克隆了PtAP1基因上游1000bp的啟動子序列，在線軟件分析表明其序列上存在各種順式調控元件;PtAP1∷GUS融合表達載體轉化擬南芥結果顯示，PtAP1啟動子在擬南芥各發(fā)育時期都有一定活性，且表現出一定的時期和組織的特異性;通過對PtAP1啟動子構

7、建酵母單雜交報告載體并進行文庫篩選，獲得了直接作用于該序列的蛋白，如參與脅迫或激素調控的早光誘導蛋白(ELIP)、赤霉素調節(jié)蛋白等。
　　3、PtAGL24基因的表達分析與功能鑒定。結合RACE克隆技術分離了早實枳中AGL24的同源基因PtAGL24，通過與其基因組序列比對發(fā)現該基因包含有8個外顯子和7個內含子，其氨基酸序列與楊樹的PtrMADS9同源性較高，達79％;進化分析表明PtAGL24與其它物種中AGL24的同源基因聚在

8、一起，但與擬南芥AGL24有所分離;PtAGL24在早實枳各組織中都有表達，在成熟的花器官中相對高一些;PtAGL24蛋白主要定位于細胞核中。
　　通過對35∷PtAGL24轉基因擬南芥的表型觀察發(fā)現，轉基因株系根據其花器官形態(tài)特征可分為兩類，Ⅰ類轉基因株系中PtAGL24的表達較高，該類植株不僅表現為早花，而且在葉片及生殖器官的形態(tài)上也發(fā)生了改變，Ⅱ類轉基因株系在生殖組織的形態(tài)上則與野生型相似;PtAGL24能夠與擬南芥中內源的

9、AGL24及AGL24的互作蛋白發(fā)生互作，這種外源與內源蛋白不適當的互作可能導致了轉基因植株表型的異常;PtAGL24的啟動子在胚根突破種皮時開始表達，并且在幼苗期活性較強一些，同樣受環(huán)境低溫的誘導。
　　4、早實枳及普通枳發(fā)育相關miRNAs的比較分析。構建了早實枳及普通枳不同發(fā)育階段的小RNA文庫，并分別進行了Solexa測序，從四個文庫中獲得了141條已知的miRNAs和75條新穎的miRNAs;通過進行表達分析，發(fā)現成年階