實(shí)驗(yàn)動(dòng)物金黃色葡萄球菌LAMP檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)廣泛存在于空氣和水中，是一種條件致病菌，可以影響鼠群繁育并對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成極大的干擾。因此，開(kāi)發(fā)快速實(shí)驗(yàn)動(dòng)物金黃色葡萄球菌檢測(cè)技術(shù)具有較高的應(yīng)用價(jià)值。環(huán)介恒溫?cái)U(kuò)增方法(LAMP)能夠特異、靈敏地對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，具有簡(jiǎn)便、快速和成本低廉等特點(diǎn)，能夠滿足這一需求。
　　 本研究確定了金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)、菌體計(jì)數(shù)方法，并制備了金黃色葡萄球菌DNA的試劑盒提取液和熱

2、裂解法粗提提取液，分別作為L(zhǎng)AMP檢測(cè)的模板。針對(duì)金黃色葡萄球菌特異的nuc基因設(shè)計(jì)4條引物，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)優(yōu)化，設(shè)定條件為60℃,40min，Mg2+濃度8mM，dNTP濃度2.0mM，甜菜堿濃度0.8mM時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌檢測(cè)限為2cfu，且與其它常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致病菌未出現(xiàn)交叉反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)果可通過(guò)添加熒光染料SYBRGreenⅠ直接肉眼觀察。
　　 利用設(shè)計(jì)的金黃色葡萄球菌LAMP法引物，分別對(duì)金黃色葡萄球菌ATC

3、C25923以及本實(shí)驗(yàn)室分離、保藏的金黃色葡萄球菌、沙門菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、假結(jié)核耶爾森菌、肺炎克雷伯菌進(jìn)行擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳顯示，只有金黃色葡萄球菌ATCC25923和本實(shí)驗(yàn)室保藏的金黃色葡萄球菌地方分離株擴(kuò)增結(jié)果呈陽(yáng)性。進(jìn)一步證明了nuc基因的特異性，說(shuō)明nuc基因可以作為檢測(cè)金黃色葡萄球菌的可靠靶序列。
　　 本研究建立的金黃色葡萄球菌LAMP方法具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低的特點(diǎn)，不僅可以應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的金