白藜蘆醇通過SIRT1-IGF-1R-AKT通路促進(jìn)退變椎間盤終板軟骨細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì).pdf

1、椎間盤退變是導(dǎo)致頸及腰背痛的常見原因。椎間盤是人體最大的缺氧組織，除了纖維環(huán)外層有血供分布外，纖維環(huán)內(nèi)層及髓核無血管分布，髓核細(xì)胞所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需要通過終板軟骨自椎體向髓核彌散滲透。隨著年齡增長(zhǎng)，終板軟骨細(xì)胞衰老凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)合成減少，降解加速，軟骨下椎體骨質(zhì)增生鈣化，導(dǎo)致彌散功能降低，不僅阻礙了椎間盤髓核所需要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如糖及氧份，同時(shí)使代謝廢物如乳酸的排泄收到抑制，加重了椎間盤這個(gè)人體最大缺氧組織的營(yíng)養(yǎng)障礙，加速并促進(jìn)了椎間盤的退變

2、。盡管椎間盤退變的確切分子機(jī)制尚不完全清楚，但是毫無疑問終板軟骨細(xì)胞的退變，終板通透性降低，在椎間盤的退變過程中發(fā)揮了重要作用。因此，預(yù)防并降低終板軟骨細(xì)胞的退變成為阻止椎間盤退變的潛在靶點(diǎn)。
　　2003年KT Howitz和Sinclair等首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道白黎蘆醇，其屬于sirtuin激活復(fù)合物(sirtuin activating compounds，STACs)，而且在一系列多酚類物質(zhì)對(duì)SIRT1的作用活性檢測(cè)中，白黎蘆醇

3、的激活作用最強(qiáng)。從此Res作為SIRT1的激活因子，被廣泛應(yīng)用到科學(xué)研究當(dāng)中。
　　眾多學(xué)者證實(shí)，SIRT1是哺乳動(dòng)物延緩衰老、延長(zhǎng)壽命的關(guān)鍵分子，在細(xì)胞周期、代謝、分化等方面發(fā)揮廣泛調(diào)節(jié)作用。Dvir-Ginzberg等證實(shí)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的SIRT1高表達(dá)能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)基因Aggrecan，collagen2a(α1)and2b(α1)，collagen9(α1)的表達(dá)。Gagarina VG等證實(shí)骨性關(guān)節(jié)炎患者SIRT

4、1可抑制軟骨細(xì)胞凋亡。
　　既往研究表明，IGF-1可明顯地促進(jìn)多種來源的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分裂增殖和軟骨基質(zhì)的合成，刺激軟骨細(xì)胞合成軟骨基質(zhì)特異型蛋白-Ⅱ型膠原和蛋白多糖，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的堿性磷酸酯酶的活性。
　　本研究首先探討了不同濃度及時(shí)間的白藜蘆醇對(duì)退變椎間盤終板軟骨細(xì)胞表達(dá)SIRT1的影響，為后續(xù)研究提供參考；其次通過SIRT1特異性siRNA及SIRT1酶活性抑制劑尼克酰胺的阻斷作用，研究了白藜蘆醇促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成的作

5、用及其與SIRT的關(guān)系；并通過IGF-1R/AKT通路特異性抑制劑的阻斷作用，研究了白藜蘆醇在退變的終板軟骨細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成的作用與IGF-1R/AKT通路的關(guān)系；從而闡明了白藜蘆醇對(duì)退變椎間盤終板軟骨細(xì)胞抑制退變的作用及其信號(hào)通路。
　　1、白藜蘆醇對(duì)退變椎間盤終板軟骨細(xì)胞SIRT1表達(dá)的影響
　　目的：探討不同濃度及時(shí)間的白藜蘆醇對(duì)退變椎間盤終板軟骨細(xì)胞表達(dá)SIRT1的影響。
　　方法：老年患者的終板軟骨細(xì)

6、胞培養(yǎng)、傳代，P2代細(xì)胞隨機(jī)分組，分別用不同濃度及作用時(shí)間的白藜蘆醇干預(yù)，終止培養(yǎng)后檢測(cè)SIRT1蛋白及SIRT1 mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：與空白對(duì)照組相比較，白藜蘆醇能夠顯著促進(jìn)退變椎間盤終板軟骨細(xì)胞表達(dá)SIRT1蛋白的最低條件為12.5μ mol/L干預(yù)24小時(shí)，以及50μ mol/L干預(yù)12小時(shí)(P<0.05)；能夠顯著上調(diào)SIRT1基因轉(zhuǎn)錄水平的最低條件為12.5μ mol/L干預(yù)作用48小時(shí)，以及50μmol/L干

7、預(yù)24小時(shí)(P<0.05)；在上述濃度、時(shí)間組合條件之上，白藜蘆醇的作用呈現(xiàn)濃度、時(shí)間依賴性。
　　結(jié)論：白藜蘆醇可顯著促進(jìn)退變椎間盤終板軟骨細(xì)胞SIRT1蛋白及mRNA表達(dá)水平，且該作用呈現(xiàn)濃度、時(shí)間依賴關(guān)系。
　　2、白藜蘆醇通過SIRT1途徑促進(jìn)退變椎間盤終板軟骨細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)
　　目的：探討白藜蘆醇干預(yù)對(duì)退變椎間盤終板軟骨細(xì)胞SIRT1的影響及其與細(xì)胞外基質(zhì)合成的關(guān)系。
　　方法：老年腰椎間盤突出癥患

8、者的終板軟骨細(xì)胞培養(yǎng)、傳代，P2代細(xì)胞隨機(jī)分為5組，即白藜蘆醇組、二甲基亞砜對(duì)照組、白藜蘆醇+尼克酰胺組、白藜蘆醇+siRNA轉(zhuǎn)染組及空白對(duì)照組。各組進(jìn)行對(duì)應(yīng)處理后檢測(cè)SIRT1、COLA2、aggrecan及SIRT1 mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：白藜蘆醇干預(yù)上調(diào)退變椎間盤終板軟骨細(xì)胞SIRT1基因的轉(zhuǎn)錄水平及SIRT1蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(COLA2、aggrecan)的合成；Nam及siRNA干預(yù)分別有效抑制了S

9、IRT1酶活性及SIRT1 mRNA的表達(dá)，并抑制了細(xì)胞外基質(zhì)的合成。
　　結(jié)論：白藜蘆醇可促進(jìn)退變椎間盤終板軟骨細(xì)胞合成軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分(Ⅱ型膠原、aggrecan)，抑制椎間盤軟骨終板退變，其機(jī)制與調(diào)節(jié)SIRT1基因轉(zhuǎn)錄及SIRT1酶活性有關(guān)。
　　3、白藜蘆醇通過IGF-1R/AKT通路促進(jìn)退變椎間盤終板軟骨細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)
　　目的：探討IGF-1R/AKT信號(hào)通路在白藜蘆醇促進(jìn)椎間盤軟骨終板細(xì)胞合成細(xì)胞外

10、基質(zhì)的影響(Ⅱ型膠原及aggrecan)。
　　方法：椎間盤軟骨終板細(xì)胞培養(yǎng)，傳代，P2代細(xì)胞培養(yǎng)12h后，隨機(jī)分為5組，各組加入對(duì)應(yīng)試劑培養(yǎng)12 h后終止培養(yǎng)，檢測(cè)IGF-1R、pIGF-1R、AKT、pAKT、COLAII、aggrecan的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：白藜蘆醇干預(yù)后IGF-1R及AKT磷酸化水平顯著增加，COLAⅡ、aggecan表達(dá)顯著增加；分別加入AG1024及SH-5則顯著抑制了胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(