白藜蘆醇通過SIRT1-IGF-1R-AKT通路促進退變椎間盤終板軟骨細胞合成細胞外基質(zhì).pdf

1、椎間盤退變是導致頸及腰背痛的常見原因。椎間盤是人體最大的缺氧組織，除了纖維環(huán)外層有血供分布外，纖維環(huán)內(nèi)層及髓核無血管分布，髓核細胞所需營養(yǎng)物質(zhì)需要通過終板軟骨自椎體向髓核彌散滲透。隨著年齡增長，終板軟骨細胞衰老凋亡，細胞外基質(zhì)合成減少，降解加速，軟骨下椎體骨質(zhì)增生鈣化，導致彌散功能降低，不僅阻礙了椎間盤髓核所需要營養(yǎng)物質(zhì)，如糖及氧份，同時使代謝廢物如乳酸的排泄收到抑制，加重了椎間盤這個人體最大缺氧組織的營養(yǎng)障礙，加速并促進了椎間盤的退變

2、。盡管椎間盤退變的確切分子機制尚不完全清楚，但是毫無疑問終板軟骨細胞的退變，終板通透性降低，在椎間盤的退變過程中發(fā)揮了重要作用。因此，預防并降低終板軟骨細胞的退變成為阻止椎間盤退變的潛在靶點。
　　2003年KT Howitz和Sinclair等首次發(fā)現(xiàn)并報道白黎蘆醇，其屬于sirtuin激活復合物(sirtuin activating compounds，STACs)，而且在一系列多酚類物質(zhì)對SIRT1的作用活性檢測中，白黎蘆醇

3、的激活作用最強。從此Res作為SIRT1的激活因子，被廣泛應用到科學研究當中。
　　眾多學者證實，SIRT1是哺乳動物延緩衰老、延長壽命的關鍵分子，在細胞周期、代謝、分化等方面發(fā)揮廣泛調(diào)節(jié)作用。Dvir-Ginzberg等證實人關節(jié)軟骨細胞的SIRT1高表達能夠促進軟骨細胞外基質(zhì)基因Aggrecan，collagen2a(α1)and2b(α1)，collagen9(α1)的表達。Gagarina VG等證實骨性關節(jié)炎患者SIRT

4、1可抑制軟骨細胞凋亡。
　　既往研究表明，IGF-1可明顯地促進多種來源的關節(jié)軟骨細胞分裂增殖和軟骨基質(zhì)的合成，刺激軟骨細胞合成軟骨基質(zhì)特異型蛋白-Ⅱ型膠原和蛋白多糖，增強成骨細胞的堿性磷酸酯酶的活性。
　　本研究首先探討了不同濃度及時間的白藜蘆醇對退變椎間盤終板軟骨細胞表達SIRT1的影響，為后續(xù)研究提供參考；其次通過SIRT1特異性siRNA及SIRT1酶活性抑制劑尼克酰胺的阻斷作用，研究了白藜蘆醇促進細胞外基質(zhì)合成的作

5、用及其與SIRT的關系；并通過IGF-1R/AKT通路特異性抑制劑的阻斷作用，研究了白藜蘆醇在退變的終板軟骨細胞中促進細胞外基質(zhì)合成的作用與IGF-1R/AKT通路的關系；從而闡明了白藜蘆醇對退變椎間盤終板軟骨細胞抑制退變的作用及其信號通路。
　　1、白藜蘆醇對退變椎間盤終板軟骨細胞SIRT1表達的影響
　　目的：探討不同濃度及時間的白藜蘆醇對退變椎間盤終板軟骨細胞表達SIRT1的影響。
　　方法：老年患者的終板軟骨細

6、胞培養(yǎng)、傳代，P2代細胞隨機分組，分別用不同濃度及作用時間的白藜蘆醇干預，終止培養(yǎng)后檢測SIRT1蛋白及SIRT1 mRNA表達水平。
　　結果：與空白對照組相比較，白藜蘆醇能夠顯著促進退變椎間盤終板軟骨細胞表達SIRT1蛋白的最低條件為12.5μ mol/L干預24小時，以及50μ mol/L干預12小時(P<0.05)；能夠顯著上調(diào)SIRT1基因轉(zhuǎn)錄水平的最低條件為12.5μ mol/L干預作用48小時，以及50μmol/L干

7、預24小時(P<0.05)；在上述濃度、時間組合條件之上，白藜蘆醇的作用呈現(xiàn)濃度、時間依賴性。
　　結論：白藜蘆醇可顯著促進退變椎間盤終板軟骨細胞SIRT1蛋白及mRNA表達水平，且該作用呈現(xiàn)濃度、時間依賴關系。
　　2、白藜蘆醇通過SIRT1途徑促進退變椎間盤終板軟骨細胞合成細胞外基質(zhì)
　　目的：探討白藜蘆醇干預對退變椎間盤終板軟骨細胞SIRT1的影響及其與細胞外基質(zhì)合成的關系。
　　方法：老年腰椎間盤突出癥患

8、者的終板軟骨細胞培養(yǎng)、傳代，P2代細胞隨機分為5組，即白藜蘆醇組、二甲基亞砜對照組、白藜蘆醇+尼克酰胺組、白藜蘆醇+siRNA轉(zhuǎn)染組及空白對照組。各組進行對應處理后檢測SIRT1、COLA2、aggrecan及SIRT1 mRNA表達水平。
　　結果：白藜蘆醇干預上調(diào)退變椎間盤終板軟骨細胞SIRT1基因的轉(zhuǎn)錄水平及SIRT1蛋白的表達水平，促進細胞外基質(zhì)(COLA2、aggrecan)的合成；Nam及siRNA干預分別有效抑制了S

9、IRT1酶活性及SIRT1 mRNA的表達，并抑制了細胞外基質(zhì)的合成。
　　結論：白藜蘆醇可促進退變椎間盤終板軟骨細胞合成軟骨細胞外基質(zhì)成分(Ⅱ型膠原、aggrecan)，抑制椎間盤軟骨終板退變，其機制與調(diào)節(jié)SIRT1基因轉(zhuǎn)錄及SIRT1酶活性有關。
　　3、白藜蘆醇通過IGF-1R/AKT通路促進退變椎間盤終板軟骨細胞合成細胞外基質(zhì)
　　目的：探討IGF-1R/AKT信號通路在白藜蘆醇促進椎間盤軟骨終板細胞合成細胞外

10、基質(zhì)的影響(Ⅱ型膠原及aggrecan)。
　　方法：椎間盤軟骨終板細胞培養(yǎng)，傳代，P2代細胞培養(yǎng)12h后，隨機分為5組，各組加入對應試劑培養(yǎng)12 h后終止培養(yǎng)，檢測IGF-1R、pIGF-1R、AKT、pAKT、COLAII、aggrecan的表達變化。
　　結果：白藜蘆醇干預后IGF-1R及AKT磷酸化水平顯著增加，COLAⅡ、aggecan表達顯著增加；分別加入AG1024及SH-5則顯著抑制了胰島素樣生長因子1受體(