卡那霉素和速尿?qū)е码嗍蠖@及其基因治療的探索性研究.pdf

1、感音神經(jīng)性聾嚴(yán)重影響著人類(lèi)的健康和生存質(zhì)量，但目前尚無(wú)有效治療方法，一般認(rèn)為，毛細(xì)胞再生是治療感音神經(jīng)性聾的關(guān)鍵。近幾年對(duì)聽(tīng)覺(jué)和聽(tīng)力損失分子機(jī)理的理解，結(jié)合基因和分子治療內(nèi)耳疾病的進(jìn)步給臨床治療感音神經(jīng)性聾提供了可行性，使基因治療有望成為治療內(nèi)耳疾病的新技術(shù)。本研究擬行藥物性聾動(dòng)物模型建立及其評(píng)價(jià)，并進(jìn)行內(nèi)耳Hath1基因?qū)胝T導(dǎo)毛細(xì)胞再生，探索基因治療的可能性。分為以下三個(gè)部分。 第一部分：卡那霉素和速尿聯(lián)合用藥后豚鼠聽(tīng)功能損

2、害 試驗(yàn)豚鼠肌肉注射硫酸卡那霉素(500mg/kg)2小時(shí)后給予速尿(50mg/kg)靜脈注射，分別于用藥3天、7天及2月行聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)電位(auditory brainstem response ABR)檢測(cè)，用藥3天行聽(tīng)神經(jīng)復(fù)合動(dòng)作電位(compound action potential CAP)及耳蝸微音電位(cochlear microphonicCM)檢測(cè)，對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組豚鼠耳蝸聽(tīng)功能結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豚鼠

3、耳毒性藥物敏感性不同，僅約半數(shù)豚鼠出現(xiàn)聽(tīng)功能?chē)?yán)重受損(ABR閾值＞95dBSPL)；用藥3天組各頻率短純音誘發(fā)的ABR閾值(2kHz，4kHz，8kHz，16kHz)明顯比對(duì)照組提高(p＜0.01)，而用藥3天組、用藥7天組和用藥2月組各頻率ABR閾值比較無(wú)差別(p＞0.05)；發(fā)現(xiàn)部分豚鼠用藥后CAP閾值輕度提高，但是CM明顯異常；用藥2月后嚴(yán)重致聾豚鼠聽(tīng)力無(wú)恢復(fù)。 結(jié)論：卡那霉素和速尿聯(lián)合用藥可導(dǎo)致約半數(shù)豚鼠聽(tīng)功能?chē)?yán)重受損并

4、且用藥2月致聾豚鼠聽(tīng)力無(wú)恢復(fù)。卡那霉素和速尿聯(lián)合用藥是建立藥物性聾動(dòng)物模型的一種快速且較可靠的方法。 第二部分：卡那霉素和速尿聯(lián)合用藥后豚鼠耳蝸毛細(xì)胞和聽(tīng)神經(jīng)損害觀察 對(duì)藥物損傷致聾豚鼠(ABR閾值＞95dBSPL)進(jìn)行耳蝸切片鋪片、掃描電鏡及毛細(xì)胞死亡模式觀察，發(fā)現(xiàn)耳蝸毛細(xì)胞嚴(yán)重受損，以外毛細(xì)胞(OHCs)缺失為主，耳蝸第一、二回毛細(xì)胞缺失比第三、四回嚴(yán)重，嚴(yán)重致聾的豚鼠內(nèi)毛細(xì)胞(IHCs)也廣泛缺失，但是切片顯示柯替

5、氏器的支持細(xì)胞存在；聯(lián)合用藥1周開(kāi)始豚鼠的聽(tīng)神經(jīng)出現(xiàn)損害，與OHCs連接的神經(jīng)纖維損害為主；隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng)，聽(tīng)神經(jīng)損害加重，而且耳蝸第一、二回聽(tīng)神經(jīng)損害比第三、四回嚴(yán)重；掃描電鏡發(fā)現(xiàn)耳蝸第一、二回IHCs和OHCs靜纖毛散亂、融合，毛細(xì)胞全部被瘢痕替代。發(fā)現(xiàn)KM/速尿給藥6小時(shí)豚鼠耳蝸出現(xiàn)OHCs核固縮和核腫脹，給藥9小時(shí)豚鼠耳蝸OHCs核腫脹數(shù)目增多，OHCs核固縮和核腫脹多見(jiàn)于耳蝸第一回，豚鼠耳蝸各回IHCs顯示正常毛細(xì)胞特征。給

6、藥6小時(shí)和給藥9小時(shí)豚鼠耳蝸用TUNEL技術(shù)檢測(cè)凋亡DNA片段，沒(méi)有觀察到陽(yáng)性著色細(xì)胞。 結(jié)論：卡那霉素和速尿聯(lián)合用藥后不僅有毛細(xì)胞廣泛缺失，而且伴隨聽(tīng)神經(jīng)損害，隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng)，聽(tīng)神經(jīng)損害加重；毛細(xì)胞死亡模式有凋亡和壞死兩種方式。 第三部分：卡那霉素和速尿致聾豚鼠的Hath1基因治療 對(duì)致聾豚鼠(ABR閾值＞95dBSPL)進(jìn)行基因治療探索性研究。致聾豚鼠經(jīng)完整圓窗膜途徑導(dǎo)入促進(jìn)毛細(xì)胞再生的Hath1基因，結(jié)果

7、發(fā)現(xiàn)用藥4周、用藥8周ABR閾值與用藥前相比沒(méi)有差別；與導(dǎo)入前相比較，所有空白對(duì)照組和導(dǎo)入人工淋巴液的豚鼠導(dǎo)入耳沒(méi)有發(fā)現(xiàn)毛細(xì)胞增多或再生，10只導(dǎo)入Ad.Hath1-EGFP豚鼠中只有1只導(dǎo)入耳耳蝸第三回毛細(xì)胞明顯比未導(dǎo)入耳增多。致聾豚鼠經(jīng)腹側(cè)入路暴露聽(tīng)泡，去除部分聽(tīng)泡骨暴露鼓階，于鼓階近圓窗處打孔微量注射器導(dǎo)入Hath1基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)非導(dǎo)入耳ABR閾值導(dǎo)入前后無(wú)改變，導(dǎo)入耳ABR閾值與自身非導(dǎo)入耳比較無(wú)明顯差別，導(dǎo)入耳組ABR閾值與對(duì)