突變體p53通過(guò)抑制miR-26a上調(diào)EZH2促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討突變體p53促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的分子機(jī)制。
　　內(nèi)容：檢測(cè)突變體p53和EZH2在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)并分析二者相互關(guān)系和EZH2與臨床病理參數(shù)之間關(guān)系，探討突變體p53與EZH2之間互相調(diào)控關(guān)系及分子機(jī)制，評(píng)估 miR-26a對(duì) TP53突變細(xì)胞生物學(xué)行為影響，檢測(cè)患者血清中miR-26a表達(dá)并分析與患者預(yù)后關(guān)系。
　　方法：用免疫組化、Western blot、細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)蛋白表達(dá)，用q

2、RT-PCR檢測(cè)miRNA和miRNA表達(dá)，用siRNA和shRNA沉默基因表達(dá)，用過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和慢病毒上調(diào)基因表達(dá)，用ChIP-PCR和 RNA-ChIP檢測(cè)蛋白質(zhì)與核酸相互作用，用CO-IP檢測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用，用熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒驗(yàn)證miRNA下游靶基因，用Transwell實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移及侵襲能力改變。
　　結(jié)果：與I型子宮內(nèi)膜癌相比，EZH2與p53均高表達(dá)于II型子宮內(nèi)膜癌中，且二者間存在顯著正相關(guān)，EZH2高表達(dá)

3、提示臨床分期晚、深肌層浸潤(rùn)、病理分級(jí)高和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。沉默突變型p53發(fā)現(xiàn)EZH2蛋白表達(dá)出現(xiàn)顯著降低，但其mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯改變。突變型p53通過(guò)抑制miR-26a表達(dá)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控EZH2蛋白表達(dá)。機(jī)制為p53突變一方面失去與miR-26a-1啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合而失去對(duì)其轉(zhuǎn)錄激活作用，另一方面通過(guò)干擾 Drosha-p68復(fù)合體組裝，削弱對(duì)pri-miR-26a-1剪切，二者共同降低 miR-26a成熟體表達(dá)量。EZH2是 miR-

4、26a下游直接調(diào)控靶標(biāo)。外源性miR-26a轉(zhuǎn)入顯著抑制p53突變HEC-1B細(xì)胞的遷移和侵襲能力,同時(shí)逆轉(zhuǎn)其EMT轉(zhuǎn)化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-26a能有效降低TP53突變的HEC-1B細(xì)胞成瘤能力。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)共同證實(shí)了 miR-26a能有效上調(diào)E-cadherin表達(dá)，而抑制 N-cadherin、Vimentin、Snail表達(dá)。此外體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了miR-26a負(fù)性調(diào)控EZH2蛋白表達(dá)。miR-26a在II型內(nèi)膜癌患者血清中顯著低表

5、達(dá)，且與預(yù)后不良相關(guān)。
　　結(jié)論：TP53突變通過(guò)突變體p53/miR-26a/EZH2調(diào)控軸促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而增加子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲能力，miR-26a不僅可能成為治療p53突變“高危型”內(nèi)膜癌靶標(biāo)還可能成為判斷子宮內(nèi)膜癌預(yù)后標(biāo)志物。
　　第一部分： EZH2與突變體p53在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及意義
　　目的：分析EZH2在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系以及與p53表達(dá)相

6、關(guān)性。
　　方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法半定量檢測(cè)子宮內(nèi)膜腺癌組織中EZH2和p53蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　(1)與I型子宮內(nèi)膜癌相比，EZH2與p53在II型子宮內(nèi)膜癌組織中均高表達(dá)（P＜0.001）。
　　(2) EZH2與p53表達(dá)呈顯著正相關(guān)（Spearman correlation r=0.739）。
　　(3) EZH2高表達(dá)提示臨床分期晚（P＜0.001）、深肌層浸潤(rùn)（P＜0.023）、病理

7、分級(jí)高（P＜0.001）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.002）。
　　結(jié)論：EZH2與p53均在II型子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)，且二者間存在顯著正相關(guān)；EZH2高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展相關(guān)。
　　第二部分：突變體p53通過(guò)下調(diào)miR-26a促進(jìn)EZH2表達(dá)
　　目的：選用TP53野生型與突變型不同子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株，探索突變體p53與EZH2表達(dá)相關(guān)性及調(diào)控關(guān)系。
　　方法：應(yīng)用蛋白印記（Western blot）方法檢測(cè)子宮

8、內(nèi)膜癌細(xì)胞株中EZH2與p53蛋白的表達(dá)；分別使用EZH2 siRNA、TP53 siRNA及陰性對(duì)照分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEC-1B和KLE細(xì)胞，分別應(yīng)用qRT-PCR方法和Western blot方法檢測(cè)EZH2和p53 mRNA和蛋白的表達(dá)；應(yīng)用在線生物信息學(xué)軟件（TargetScan）預(yù)測(cè)可能調(diào)控EZH2表達(dá)的miRNA，應(yīng)用qRT-PCR篩選突變體p53可能抑制的miRNA；分別使用miR-26a mimics、miR-26a inh

9、ibitors（anti-miR-26a）及陰性對(duì)照瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEC-1B和Ishikawa細(xì)胞，分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后EZH2 mRNA和蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　(1)與SPEC-2和 Ishikawa細(xì)胞相比，EZH2在AN3CA和TP53突變的HEC-1B和KLE細(xì)胞中高表達(dá)(P＜0.001)。
　　(2)沉默EZH2后突變體p53 mRNA及蛋白均無(wú)明顯改變（P＞0.05）。
　　(3)沉默突變體p53后

10、EZH2蛋白出現(xiàn)明顯降低（P＜0.05）但其mRNA無(wú)改變（P＞0.05）。
　　(4)沉默突變體p53顯著增加HEC-1B和KLE細(xì)胞中miR-26a表達(dá)(P＜0.05)。
　　(5) miR-26a mimics轉(zhuǎn)入HEC-1B細(xì)胞抑制EZH2蛋白表達(dá)，anti-miR-26a轉(zhuǎn)入 Ishikawa細(xì)胞增加EZH2蛋白表達(dá)，均不影響mRNA水平改變。
　　結(jié)論：突變體p53可能通過(guò)抑制miR-26a促進(jìn)EZH2蛋白

11、表達(dá)
　　第三部分：突變體p53通過(guò)下調(diào)miR-26a促進(jìn)EZH2表達(dá)分子機(jī)制
　　目的：探索突變體p53下調(diào)miR-26a分子機(jī)制以及EZH2是miR-26a直接調(diào)控靶標(biāo)驗(yàn)證。
　　方法：分別使用TP53 siRNA及陰性對(duì)照分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEC-1B細(xì)胞，應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后pre-miR-26a-1、pre-miR-26a-2表達(dá)變化；應(yīng)用ChIP-PCR方法檢測(cè)突變體p53、野生型p53與miR-26a

12、-1啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合能力；應(yīng)用免疫共沉淀（CO-IP）方法檢測(cè)突變體p53與p68相互作用、p68與Drosha蛋白相互作用；分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p68 shRNA與p68過(guò)表達(dá)質(zhì)粒至HEC-1B細(xì)胞和無(wú)TP53的HEC-50細(xì)胞，應(yīng)用qRT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后miR-26a表達(dá)變化；分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同突變體p53與野生型p53表達(dá)質(zhì)粒至無(wú)TP53的HEC-50細(xì)胞，應(yīng)用Western blot方法和qRT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后EZH2蛋白及

13、miR-26a表達(dá)變化；應(yīng)用RNA-ChIP方法檢測(cè)p68、Drosha蛋白與pri-miR-26a-1相互作用，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和應(yīng)用雙熒光素酶檢測(cè)檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證EZH2是miR-26a調(diào)控靶標(biāo)。
　　結(jié)果：
　　(1)沉默突變體p53后pre-miR-26a-1和pre-miR-26a-2表達(dá)均升高約2倍（P＜0.005），但pre-miR-26a-1基線表達(dá)量是pre-miR-26a表達(dá)量近150倍（P＜0.0001

14、）。
　　(2)野生型p53與miR-26a-1啟動(dòng)子區(qū)域能力顯著顯著大于突變體p53。
　　(3)突變體p53與p68相互結(jié)合，沉默p68顯著降低miR-26a表達(dá)（P＜0.001），外源性p68再表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-26a表達(dá)。
　　(4)野生型p53轉(zhuǎn)入HEC-50細(xì)胞增加miR-26a表達(dá)而顯著抑制EZH2蛋白表達(dá)，突變體p53轉(zhuǎn)入HEC-50細(xì)胞抑制miR-26a表達(dá)而顯著增加EZH2蛋白表達(dá)。
　　(5)

15、野生型 p53轉(zhuǎn)入 HEC-50細(xì)胞不影響 pri-miR-26a-1表達(dá)，但顯著增加pre-miR-26a-1表達(dá)；突變體 p53轉(zhuǎn)入 HEC-50細(xì)胞不影響 pri-miR-26a-1表達(dá)，但不同程度顯著抑制pre-miR-26a-1表達(dá)。
　　(6)野生型p53轉(zhuǎn)入HEC-50細(xì)胞增加p68與Drosha蛋白相互作用，而突變型p53轉(zhuǎn)入HEC-50細(xì)胞顯著抑制p68與Drosha蛋白相互作用
　　(7)野生型p53轉(zhuǎn)入

16、HEC-50細(xì)胞增加p68、Drosha蛋白與pri-miR-26a-1相互作用，而突變型 p53轉(zhuǎn)入 HEC-50細(xì)胞顯著抑制 p68、Drosha蛋白與pri-miR-26a-1相互作用。
　　(8)野生型EZH23’非翻譯區(qū)（EZH23’UTR）組，miR-26a轉(zhuǎn)入降低熒光強(qiáng)度超過(guò)65%(P＜0.001)，然而突變型EZH23’UTR組，miR-26a轉(zhuǎn)入熒光強(qiáng)度僅出現(xiàn)輕度減低(P=0.0122)。
　　結(jié)論：p53

17、突變一方面通過(guò)失去與miR-26a-1啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，失去其轉(zhuǎn)錄激活作用，另一方面通過(guò)干擾Drosha-p68復(fù)合體組裝削弱pri-miR-26a-1處理，共同減少miR-26a表達(dá)量，EZH2是miR-26a下游直接調(diào)控靶標(biāo)，miR-26a表達(dá)減少失去對(duì)EZH2表達(dá)抑制，故EZH2在突變型子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)。
　　第四部分：miR-26a對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響
　　目的：探索miR-26a對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移、侵襲

18、及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響。
　　方法：分別使用miR-26a mimics及陰性對(duì)照瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 EZH2高表達(dá) HEC-1B和AN3CA細(xì)胞，分別使用anti-miR-26a及陰性對(duì)照瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞，應(yīng)用transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移、侵襲能力改變，應(yīng)用Western blot方法和免疫熒光方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）指標(biāo)E-cadherin、N-cadherin

19、、Vimentin和Snail蛋白表達(dá)變化。
　　(1)再表達(dá)miR-26a顯著抑制TP53突變的HEC-1B細(xì)胞遷移及侵襲能力，亦抑制EZH2高表達(dá)AN3CA細(xì)胞侵襲能力。
　　(2)抑制miR-26a表達(dá)增加EZH2低表達(dá)Ishikawa細(xì)胞侵襲能力。
　　(3) miR-26a上調(diào)TP53突變的HEC-1B細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)，抑制間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin及Sn

20、ail蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：miR-26a通過(guò)抑制EZH2促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（MET）。
　　第五部分：miR-26a調(diào)控EZH2表達(dá)發(fā)揮抑癌作用體內(nèi)驗(yàn)證
　　目的：探索miR-26a對(duì)TP53突變的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響并進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-26a對(duì)理論靶基因EZH2的表達(dá)調(diào)控。
　　方法：構(gòu)建包裝miR-26a表達(dá)慢病毒（LV-miR-26a）及陰性對(duì)照，分別轉(zhuǎn)染TP53突變的

21、HEC-1B細(xì)胞后注射于成熟雌性裸鼠頸部皮下進(jìn)行成瘤實(shí)驗(yàn)，分別繪制瘤體生長(zhǎng)曲線，進(jìn)行瘤體稱(chēng)重，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)移植瘤中E-cadherin、Vimentin、EZH2和Ki67蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　(1)轉(zhuǎn)染miR-26a表達(dá)慢病毒組腫瘤的體積和瘤體重量明顯小于對(duì)照組。
　　(2)轉(zhuǎn)染miR-26a表達(dá)慢病毒組瘤體組織中上皮標(biāo)志物E-cadherin高表達(dá)、間充質(zhì)標(biāo)標(biāo)記物Vimentin低表達(dá)、增殖指標(biāo)K

22、i67低表達(dá)。
　　(3)轉(zhuǎn)染miR-26a表達(dá)慢病毒組瘤體組織中miR-26a下游調(diào)控靶標(biāo)EZH2低表達(dá)。
　　結(jié)論：體內(nèi)miR-26a負(fù)性調(diào)控下游靶標(biāo)EZH2蛋白的表達(dá)并發(fā)揮抑癌基因作用。
　　第六部分：血清miR-26a表達(dá)與臨床預(yù)后關(guān)系
　　目的：檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌患者血清中miR-26a表達(dá)并分析其與臨床預(yù)后關(guān)系。
　　方法：應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌患者血清中miR-26a表達(dá)。
　　結(jié)