Brugada綜合征SCN5A基因R1628Q突變的功能表達研究.pdf

1、目的:體外構(gòu)建含R1628Q突變的人心臟鈉離子通道α亞基真核表達載體pHL-hH1-R1628Q。研究R1628Q突變對鈉通道電生理性質(zhì)的影響，闡明Brugada綜合征的發(fā)病機制，為疾病的基因診斷和分子治療提供新的思路。
　　 方法:設(shè)計帶突變位點的引物，以含有人心臟鈉離子通道cDNA的質(zhì)粒為模板經(jīng)重疊延伸PCR法體外定點誘變，構(gòu)建R1628Q突變型人心臟鈉離子通道真核表達載體。經(jīng)酶切和DNA測序驗證后與心臟鈉離子通道β1亞基質(zhì)

2、粒pEGFP-N3-SCN1B瞬時共同轉(zhuǎn)染到HEK293，48小時后全細胞記錄鈉通道的電生理特性。
　　 結(jié)果:1.DNA測序證實突變質(zhì)粒pHL-hH1-R1628Q構(gòu)建成功。2.hH1-R1628Q鈉通道的平均峰值電流密度(-298.7±27.0pA/pF;n=22)與hH1-WT盼平均峰值電流密度(-336.7±26.9pA/pF;n=30)相比，無顯著性差異（P＞0.05）。hH1-R1628Q鈉通道的電導(dǎo)-電壓(g-v)

3、曲線與hH1-WT相似，V1/2和斜率因子k的統(tǒng)計學(xué)處理無顯著差異(P＞0.05)。3.hH1-R1628Q鈉電流的衰減時間常數(shù)在測試電壓（-50mV到0mV）明顯快于hH1-WT(P＜0.05)。相比hH1-WT，hH1-R1628Q鈉通道的穩(wěn)態(tài)失活曲線向負電位方向移動約20.6mV，統(tǒng)計學(xué)處理有顯著差異(hH1-WT:-81.1±1.3mV, n=13;hH1-R1628Q:-101.7±1.2,n=18;P＜0.05)。4.經(jīng)一定

4、間隔時間-20mV預(yù)刺激后細胞進入中間失活狀態(tài)，可以得到中間失活的時間依賴性曲線。發(fā)現(xiàn)hH1-WT和hH1-R1628Q的失活通道比例在各時間下均有顯著性差異，如經(jīng)1000ms電壓為-20mV的預(yù)刺激后R1628Q進入中間失活狀態(tài)的比例明顯提高，是WT的3.6倍（hH1-WT:19.6±1.5％，n=9;versushH1-R1628Q:69.6±1.4％，n=8，P＜0.05）。5.失活后恢復(fù)曲線經(jīng)雙指數(shù)方程擬合后得到快恢復(fù)時間常數(shù)τ

5、f(hH1-WT:3.2±0.2ms，n=11;hH1-R1628Q:22.5±1.0ms，n=12，P＜0.05)和慢恢復(fù)時間常數(shù)τs(hH1-WT:104.1±20ms，n=11;hH1-R1628Q:139.0±14.0ms，n=12，P＞0.05)。 hH1-R1628Q與hH1-WT相比，快恢復(fù)時間常數(shù)τf明顯延長，而慢恢復(fù)時間常數(shù)τs差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:1.成功構(gòu)建了Brugada綜合征SCN5A基因R1