Brugada綜合征SCN5A基因突變G1712C的功能表達研究.pdf

1、Brugada綜合征(Brugada syndrome，BrS)是一種罕見的遺傳性心律失常綜合征，具有心電圖表現(xiàn)為右胸導聯(lián)V1-V3持續(xù)性ST段抬高和高心源性猝死(sudden cardiac death，SCD)風險特征。本病因發(fā)生暈厥或心源性猝死概率高，且與青壯年猝死高度相關而日益引起人們的重視。典型心電圖表現(xiàn)為右胸前導聯(lián)（V1-V3）ST段抬高≥2 mm，可繼發(fā)T波倒置，而QT間期正常。發(fā)作時心電圖表先為極短配對間期室性期前收縮、

2、多形室速、室顫，而體格檢查和輔助檢查（胸片、心臟彩超、心臟MRI等）均無心臟器質(zhì)性病變證據(jù)。Brugada綜合征的流行病學特征目前尚無明確資料，但亞洲和東南亞國家明顯高于其他國家，達0.5/1000-1/1000。在亞洲的某些地區(qū)，Brugada綜合征是導致50歲以下青年男性自然死亡的最常見原因。近年的相關研究表明，Brugada綜合征的發(fā)病機制與許多基因突變密切相關，尤其是編碼人類心臟鈉通道α亞單位的SCN5A基因的突變，其機理可能是

3、SCN5A基因的突變導致心臟鈉通道蛋白的功能障礙。
　　目的:
　　為進一步探討B(tài)rugada綜合征離子、細胞電生理的發(fā)病機制，本研究擬通過對本課題組前期發(fā)現(xiàn)的Brugada綜合征基因SCN5A新突變G1712C進行功能表達研究。
　　方法:
　　分兩部分進行，第一部分:對含有相關SCN5A基因(G1712C)突變片段采用定點誘變PCR進行擴增，HindⅢ和XbaⅠ酶進行質(zhì)粒酶切鑒定法構建質(zhì)粒，DNA序列測定來鑒

4、定定點誘變是否成功。
　　第二部分:先應用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法得到穩(wěn)定表達的hβ1細胞系，然后再將hβ1細胞分別瞬時轉(zhuǎn)染至野生型、突變型兩種質(zhì)粒。細胞轉(zhuǎn)染后于37℃恒溫箱中孵育48小時，然后再取生長良好的細胞分別進行膜片鉗檢測。構建pcDNA3.1-GFP-SCN5A突變體質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體Lipofectamine3000分別將pcDNA3.1-GFP和pcDNA3.1-GFP-SCN5A突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至在對數(shù)生長期HEK293細胞中，轉(zhuǎn)

5、染36小時后再在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，然后激光共聚焦顯微鏡(leicaTCS SP8)下觀察綠色熒光蛋白在轉(zhuǎn)染細胞的分布情況。
　　結果:
　　成功構建了含有SCN5A基因突變G1712C的pcDNA3.1(mpcDNA3.1)表達重組體。在激光共聚焦顯微鏡下，觀察到GFP-SCN5A突變體(G1712C)主要在細胞質(zhì)的外周（細胞膜）中分布，突變位點成功定位到了細胞膜上。在野生型pcDNA3.1瞬時轉(zhuǎn)染的細胞系中，指令電