臍血單個核細胞體外誘導為肝樣細胞的研究.pdf

1、隨著胚層限制理論的打破，成體干細胞的可塑性已成為近年來的研究熱點。臍血干細胞以其干細胞含量高、來源豐富、采集簡單、比較純凈等特點可能成為包括肝細胞在內(nèi)的多種細胞的較好來源。 目的；探討在細胞外基質(zhì)人血漿纖維連接蛋白的存在下，用成纖維細胞因子4(FGF-4)和肝細胞生長因子(HGF)聯(lián)合誘導人臍血單個核細胞向肝樣細胞分化的可行性。 方法：采集足月健康產(chǎn)婦臍帶血至含CPDA抗凝劑的無菌采血袋中，用等體積3％明膠沉淀紅細胞后采

2、用密度梯度離心法分離單個核細胞，利用貼壁時間的差異去除成熟貼壁細胞，然后接種于DMEM低糖培養(yǎng)基，在用人血漿纖維連接蛋白包被過的培養(yǎng)板中進行貼壁培養(yǎng)。分為誘導組和未誘導組兩組，誘導組添加細胞因子HGF和FGF-4。在培養(yǎng)的第0、7、14、21、28天，分別以RT-PCR和免疫細胞化學染色方法檢測分析甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、角蛋白18(CK-18)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達情況。并用糖原染色(PAS)方法檢測誘導后細胞是否具有正

3、常成熟肝細胞合成糖原的功能。 結(jié)果：(1)倒置顯微鏡下觀察到的形態(tài)變化：誘導后細胞體積逐漸變大，形狀由圓形逐漸變?yōu)闄E圓形、不規(guī)則圓形、多邊形等，部分具有雙核多核呈現(xiàn)出典型的肝樣細胞的形態(tài)特點。在細胞密度較高的區(qū)域有多個細胞聚集在一起的融合現(xiàn)象，這些高密度區(qū)域的細胞形態(tài)變化較低密度區(qū)更為明顯。(2)免疫細胞化學染色結(jié)果：誘導后第7、14、21、28天ALB和CK-18染色均為陽性著色；AFP染色在誘導第7、14天呈陽性著色，第21

4、天陽性著色細胞減少，到28天基本變?yōu)殛幮?。在未誘導組這些指標均未見表達。(3)PAS染色結(jié)果：在第21天呈現(xiàn)弱陽性著色，到第28天顯示強陽性著色。無細胞因子組染色呈陰性。(4)RT-PCR結(jié)果：在誘導后7、14、21天未成熟肝細胞具有的表型AFP在轉(zhuǎn)錄水平有表達，到28天后即呈陰性表達。成熟肝細胞表型ALB和CK-18于誘導的第7天在轉(zhuǎn)錄水平就開始表達，于誘導的第14天就有明顯表達并一直持續(xù)到檢測的第28天。 結(jié)論：聯(lián)合應(yīng)用HG