RA對臍血干細胞體外向神經元樣細胞誘導分化的影響.pdf

1、目的：研究RA對臍血干細胞向神經元樣細胞定向誘導分化的影響，探討臍血干細胞向神經元樣細胞分化的條件．，從而為研究臍血干細胞移植修復脊髓損傷提供實驗基礎。 方法：用密度梯度離心法從臍血中無菌分離單個核細胞(MNCs)置于含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，并在相同條件下擴增、傳代，然后取體外擴增5代的臍血MSCs，接種于6孔培養(yǎng)板內，在培養(yǎng)液中加入10ng/ml的bFGF，在37℃，5％CO<,2>條件下進行預誘導24h，然后

2、吸去預誘導液，PBS洗滌3遍，加入含20％FBS的H-DMEM和20g/L的DMSO。在此基礎上加入不同濃度的RA作為誘導劑進行誘導，并根據誘導劑濃度的不同和誘導時間的不同分組，靜置培養(yǎng)觀察細胞的形態(tài)學和組織學變化。分別于誘導24h、48h和72h后取細胞進行免疫組化檢測神經元烯醇化酶(NSE)，神經絲蛋白(NF-M)及膠質纖維酸性蛋白(GFAP)然后光鏡下隨機數取10個非重疊視野(×100)，計算陽性細胞占總細胞數的比例結果用(x±s

3、)％表示，探討RA在不同時間點對臍血干細胞向神經元樣細胞分化的影響。然后于誘導72h后分別取含1μmol/L、3μmol/L、5μmol/L RA的各組細胞進行免疫組化檢測NSE、NF-M、GFAP的表達，光鏡下隨機數取10個非重疊視野(×100)，計算陽性細胞占總細胞數的比例，結果用(x±s)％表示，探討不同濃度的RA對臍血干細胞分化為神經元樣細胞的影響。 結果：hMSC分離后體外培養(yǎng)約5d呈梭形變，培養(yǎng)15d～18d細胞達到

4、80％～90％融合。(1)光鏡下觀察MSC誘導為神經元的形態(tài)變化：hMSC在預誘導液中處理24h后，梭形的臍血MSC胞體已發(fā)生收縮，細胞體積減小，部分胞體收縮成錐形或球形，細胞邊緣變得不規(guī)整。正式誘導后，胞體進一步收縮，形成圓形、不規(guī)則的錐形、三角形，有的細胞有多個突起，而且發(fā)出分支，有的突起逐漸伸長，類似神經元的長軸突，部分細胞拉成網狀，誘導72h后細胞的形態(tài)不再發(fā)生明顯的變化。(2)誘導后免疫組化檢測結果：不同誘導時間檢測顯示各實驗

5、組經誘導后NSE陽性細胞的比例隨誘導時間的延長而不斷增高。誘導72h后各組NSE陽性率結果有顯著性差異(p<0.05)。用含不同濃度RA誘導液進行誘導時，隨RA濃度的增高NSE、NF-M及GFAP的陽性細胞的比例而不斷增高。誘導后免疫組化檢測，NSE、NF-M及GFAP的陽性細胞的比例結果有顯著性差異 (p<0.05)。 結論：RA對臍血MSC體外向神經元樣細胞分化有良好的促進作用，是一種較安全的誘導劑。Imnol/L的RA能