人臍血單個(gè)核細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞研究.pdf

1、目的：研究臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的分離、體外培養(yǎng)、擴(kuò)增以及堿性成纖維生長因子(bFGF)對臍血MSCs體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化的影響，探討臍血間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的條件，為臍血MSCs臨床應(yīng)用治療脊髓損傷提供技術(shù)儲備和理論依據(jù)。 方法：用密度梯度離心法將臍血中單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)從臍血中分離出來置于含20％胎牛血清(FBS)的H-DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5％CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，72h后試驗(yàn)組加入b

2、FGF，終濃度為lOng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)并傳代，在倒置顯微鏡下追蹤觀察細(xì)胞生長情況和bFGF對臍血細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響；分別取體外培養(yǎng)后3d、7d后和13d的臍血MSCs，進(jìn)行免疫組化法檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物Nestin、MAP2和GFAP。光鏡下隨機(jī)取10個(gè)非重疊視野(×100)，計(jì)算nestin、MAP2和GFAP陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)％表示。陰性對照用0.01mol/L的PBS代替nestin、MAP2和

3、GFAP單抗。取擴(kuò)增一代的臍血MSCs，用含20g/L牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗滌后制成濃度為1.0×10<'6>/ml的單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測臍血MSCs表面標(biāo)志物。 結(jié)果：接種24 h后懸浮細(xì)胞開始逐漸貼壁，培養(yǎng)后第3d，細(xì)胞形態(tài)呈圓形，卵圓形，紡錘或者逗號樣(圖a1)，nestin陽性細(xì)胞細(xì)胞可見(圖b1)，占4.3±0.8％，MAP2和GFAP染色陰性。然后細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，有突起逐漸伸出；培養(yǎng)7d后出現(xiàn)

4、大量的貼壁細(xì)胞，以間充質(zhì)細(xì)胞為主，同時(shí)有大量的破骨樣細(xì)胞混雜，破骨樣細(xì)胞胞體較大，多個(gè)核，圓形，此時(shí)貼壁MSCs細(xì)胞形態(tài)呈長梭形，單個(gè)核，有較長的突起，折光性強(qiáng)(圖a2)，nestin、MAP2和GFAP陽性細(xì)胞陽性率分別為6.8％±0.6％、2.4％±0.6％和2.6％±0.8％；bFGF組與對照組相比，則細(xì)胞突起明顯，nestin、MAP2和GFAP陽性細(xì)胞陽性率分別為3.2％±0.4％、8.6％±l.5％和10.2％±1.8％；培

5、養(yǎng)13d后，倒置顯微鏡下可見大量呈較均一的長梭形細(xì)胞，突起更明顯，其他形狀細(xì)胞明顯減少(圖a3)，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測nestin、MAP2和GFAP陽性細(xì)胞成片狀分布(圖b2.3)，陽性率分別為8.4±0.6％、11.5±1.6％和12.4±2.7％；bFGF組大多數(shù)細(xì)胞均轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃粕窠?jīng)元樣的形態(tài)，伸出較長的突起，并可見一級和二級分支，類似神經(jīng)元樹突(圖a5)，與對照組相比形態(tài)有明顯改變。免疫細(xì)胞檢測顯示nestin蛋白陰性，MAP2和G

6、FAP陽性率分別為26.7±3.5％和28.2±2.0％，與對照組相比，有顯著性意義(p<0.01)。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測MSCs的表面抗原特性，結(jié)果示擴(kuò)增一代的MSCs不表達(dá)CD34，強(qiáng)表達(dá)CD29(圖c)。 結(jié)論：臍血MSCs在體外有較強(qiáng)的擴(kuò)增傳代能力，能夠分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。免疫組織化學(xué)鑒定結(jié)果顯示在培養(yǎng)不同時(shí)間MSCs表達(dá)的神經(jīng)細(xì)胞特有分子標(biāo)志物nestin，MAP2和GFAP陽性率各有不同。在MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)