人鼻黏膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及Hbd-2的誘導(dǎo).pdf

1、目的:
　　 以正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69作參照，建立人鼻黏膜原代上皮細(xì)胞模型，探索脂多糖(LPS)和腫瘤壞死因子a(TNF-a)對(duì)人鼻黏膜上皮細(xì)胞誘導(dǎo)hBD-2的可表達(dá)性和差異性，以及不同濃度與誘導(dǎo)hBD-2表達(dá)的強(qiáng)弱和持續(xù)時(shí)間的關(guān)系。
　　 方法:
　　 1.采用人下鼻甲黏膜，以Ⅰ型膠原酶加胰酶消化法分離上皮細(xì)胞，用添加了生長(zhǎng)因子和牛下丘腦提取物的Keratinocyte-SFM培基，在體外培養(yǎng)原代鼻黏膜上皮細(xì)

2、胞，并通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細(xì)胞和復(fù)蘇的NP69細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞角蛋白鑒定。
　　 2.應(yīng)用PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)脂多糖(LPS)和腫瘤壞死因子a(TNF-a)誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細(xì)胞和NP69細(xì)胞中hBD-2的表達(dá)量。
　　 結(jié)果:
　　 1.體外培養(yǎng)的人鼻黏膜原代細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞角蛋白AE1/AE3鑒定為上皮細(xì)胞，陽(yáng)性率高達(dá)92.97％，較NP69細(xì)胞高;
　　 2.不同質(zhì)量濃度的LPS(1、10

3、mg/L)、TNF-a(0.1、1、10、100ng/ml)刺激人鼻黏膜上皮細(xì)胞4h后，hBD-2mRNA表達(dá)呈劑量依賴性升高，兩兩比較差異顯著(p＜0.05)。
　　 3.不同質(zhì)量濃度的LPS(0.01、0.1、1、10mg/L)、TNF-a(0.1、1、10、100ng/ml)刺激人鼻咽上皮細(xì)胞(NP69)4h后，hBD-2mRNA表達(dá)均較對(duì)照組（未刺激組）降低，兩兩比較差異顯著(p＜0.05)。
　　 4.一定濃度

4、的LPS(10ug/ml)刺激培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細(xì)胞，hBD-2mRNA的表達(dá)量0-4h逐漸升高，4-24h逐漸下降，兩兩比較差異顯著(p＜0.05);一定濃度的LPS(10ug/ml)刺激培養(yǎng)的NP69不同時(shí)間后，hBD-2mRNA的表達(dá)量無(wú)明顯增加，兩兩比較無(wú)明顯差異(p＞0.05)5.一定濃度的LPS(10ug/ml)、TNF-a(100ng/ml)刺激培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細(xì)胞和NP69細(xì)胞4h后，免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)鼻黏膜上皮細(xì)胞胞漿中h

5、BD-2蛋白表達(dá);NP69細(xì)胞胞漿基本無(wú)hBD-2蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本實(shí)驗(yàn)用K-SFM培基成功培養(yǎng)了人鼻黏膜上皮細(xì)胞。
　　 2.脂多糖(LPS)和腫瘤壞死因子a(TNF-a)兩種不同的誘導(dǎo)因素均可誘導(dǎo)人鼻黏膜上皮細(xì)胞中hBD-2的表達(dá)，這種表達(dá)不僅具有差異性，而且具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性。
　　 3.相同劑量的LPS誘導(dǎo)鼻黏膜上皮細(xì)胞和NP69細(xì)胞兩種不同細(xì)胞hBD-2的表達(dá)時(shí)，其時(shí)