兩種蝮蛇毒類凝血酶基因的克隆表達與分離純化.pdf

1、大連理工大學博士學位論文兩種蝮蛇毒類凝血酶基因的克隆表達與分離純化姓名：楊青申請學位級別：博士專業(yè)：生物化工指導教師：安利佳20020101摘要物主要以可溶性的蛋白質(zhì)形式存在于細胞質(zhì)中。首次將大連蛇島蝮蛇毒類凝血酶成熟基因克隆到表達載體pPIC9K中，經(jīng)電激轉(zhuǎn)化至畢氏酵母菌株GSll5中，再經(jīng)甲醇誘導，在150ml搖瓶中獲得細胞外分泌表達產(chǎn)物。對菌體培養(yǎng)條件進行的探索表明：蛋白表達的最佳pH值應為60，最佳誘導時間為36小時，培養(yǎng)基為營

2、養(yǎng)豐富的復合培養(yǎng)基。表達產(chǎn)物的活性通過檢測其精氨酸酯酶活性和纖維蛋白原的凝結(jié)活性確定，表達量通過精氨酸酯酶活性估算約為4mg／l(培養(yǎng)液)。為研究重組類凝血酶的純化方法，選取含大連蛇島蝮蛇類凝血酶基因的畢氏酵母，其表現(xiàn)型為甲醇快速生長型HisMut的表達菌株，在500ml搖瓶中培養(yǎng)，甲醇誘導分泌表達。上清液中重組蝮蛇毒類凝血酶的純化是通過設計的不同分離純化方法組合進行的，并對每一種組合進行了活力與純度及回收率的評價，結(jié)果表明兩種組合方式

3、都具有一定的實用性和可操作性。通過對類凝血酶與胰蛋白酶的同源性分析比較，發(fā)現(xiàn)二者的催化部位結(jié)構(gòu)非常相似，并且被相同的小分子化合物benzamidine競爭性抑制，首次設計將用于親和分離胰蛋白酶的benzamidine用到純化類凝血酶上來，實驗結(jié)果表明分離達到了較好的效果。與天然蛇毒類凝血酶一致，當用三肽Pnitroanillde衍生物作為底物時，分泌表達的重組大連蛇島蝮蛇毒類凝血酶具有較強的生色底物活性，但用精氨酸甲酯如TAME(N口p