豆豉纖溶酶產(chǎn)生菌的篩選及基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、豆豉纖溶酶是從我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品豆豉中發(fā)現(xiàn)的新型纖溶酶，它具有纖溶活性高，無(wú)毒副作用，半衰期長(zhǎng)，不引起內(nèi)出血等優(yōu)點(diǎn)，因此豆豉纖溶酶無(wú)論作為抗血栓藥物還是防栓保健食品都具有十分重要的開(kāi)發(fā)價(jià)值。
　　本論文從我國(guó)民間傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中篩選出具有纖溶酶活性的產(chǎn)生菌菌株，并進(jìn)行液體發(fā)酵工藝條件優(yōu)化及其纖溶酶基因的克隆與表達(dá)研究，具體結(jié)果如下:
　　1.從多種我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中篩選出產(chǎn)纖溶酶的菌株42株，通過(guò)瓊脂糖-纖維蛋白平板比較法得

2、到其中活力最高的一株HD4，纖溶活力為613.8U/mL；通過(guò)菌落與菌體形態(tài)、生理生化試驗(yàn)結(jié)合16S rRNA基因序列測(cè)定，初步鑒定為枯草芽孢桿菌；通過(guò)DNA-MAN和MAGE4軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)菌株HD4與Bacillus subtilis在同一分支，且遺傳距離最短，從而確定菌株HD4屬于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis的一個(gè)菌株。
　　2.以HD4菌株為出發(fā)菌株，對(duì)其液體發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表

3、明:發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源為蔗糖2％，最佳氮源為酵母膏2.5％；無(wú)機(jī)鹽組分為：CaCl20.02％，K2HPO40.3％，KH2PO40.3％，MgSO4·7H2O0.07％；發(fā)酵培養(yǎng)的最佳溫度為37℃，最佳pH為7。5，通氣量以20mL/100mL為最佳，發(fā)酵周期在48h時(shí)活力最大；在該條件下發(fā)酵粗酶液纖溶酶活性達(dá)到827.2U/mL。
　　3.根據(jù)納豆激酶的核苷酸序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，以HD4菌株總DNA為模板，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增

4、豆豉纖溶酶(DFE)全基因序列(1491bp)，與pBluescript II KS連接為重組質(zhì)粒后克隆并測(cè)序，經(jīng)同源性分析發(fā)現(xiàn)其與納豆激酶(NAT)的同源性最高，為99％；根據(jù)全基因序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR獲得豆豉纖溶酶原基因的序列(1059bp)。
　　4.將克隆的纖溶酶全基因及纖溶酶原基因分別連接到 PET-27b載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)纖維蛋白板檢測(cè)纖溶活性，發(fā)現(xiàn)纖溶酶原基因在加入葡萄糖后進(jìn)行誘導(dǎo)，能實(shí)現(xiàn)分泌活