豆豉纖溶酶產(chǎn)生菌的篩選及基因的克隆與表達研究.pdf

1、豆豉纖溶酶是從我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品豆豉中發(fā)現(xiàn)的新型纖溶酶，它具有纖溶活性高，無毒副作用，半衰期長，不引起內(nèi)出血等優(yōu)點，因此豆豉纖溶酶無論作為抗血栓藥物還是防栓保健食品都具有十分重要的開發(fā)價值。
　　本論文從我國民間傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中篩選出具有纖溶酶活性的產(chǎn)生菌菌株，并進行液體發(fā)酵工藝條件優(yōu)化及其纖溶酶基因的克隆與表達研究，具體結果如下:
　　1.從多種我國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中篩選出產(chǎn)纖溶酶的菌株42株，通過瓊脂糖-纖維蛋白平板比較法得

2、到其中活力最高的一株HD4，纖溶活力為613.8U/mL；通過菌落與菌體形態(tài)、生理生化試驗結合16S rRNA基因序列測定，初步鑒定為枯草芽孢桿菌；通過DNA-MAN和MAGE4軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)菌株HD4與Bacillus subtilis在同一分支，且遺傳距離最短，從而確定菌株HD4屬于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis的一個菌株。
　　2.以HD4菌株為出發(fā)菌株，對其液體發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，結果表

3、明:發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源為蔗糖2％，最佳氮源為酵母膏2.5％；無機鹽組分為：CaCl20.02％，K2HPO40.3％，KH2PO40.3％，MgSO4·7H2O0.07％；發(fā)酵培養(yǎng)的最佳溫度為37℃，最佳pH為7。5，通氣量以20mL/100mL為最佳，發(fā)酵周期在48h時活力最大；在該條件下發(fā)酵粗酶液纖溶酶活性達到827.2U/mL。
　　3.根據(jù)納豆激酶的核苷酸序列設計了一對引物，以HD4菌株總DNA為模板，采用PCR技術擴增

4、豆豉纖溶酶(DFE)全基因序列(1491bp)，與pBluescript II KS連接為重組質(zhì)粒后克隆并測序，經(jīng)同源性分析發(fā)現(xiàn)其與納豆激酶(NAT)的同源性最高，為99％；根據(jù)全基因序列設計引物，經(jīng)PCR獲得豆豉纖溶酶原基因的序列(1059bp)。
　　4.將克隆的纖溶酶全基因及纖溶酶原基因分別連接到 PET-27b載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進行表達，通過纖維蛋白板檢測纖溶活性，發(fā)現(xiàn)纖溶酶原基因在加入葡萄糖后進行誘導，能實現(xiàn)分泌活