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文檔簡(jiǎn)介
1、阿爾茨海默病(Alzheimet's disease,AD)是一種發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的進(jìn)行性退行性疾病,β淀粉樣蛋白(Amyloid β,Aβ)的沉積是AD病變的始發(fā)因素和中心環(huán)節(jié),對(duì)抗Aβ的形成、沉積及毒性作用是治療AD的根本策略。開(kāi)發(fā)有效的針對(duì)Aβ代謝的關(guān)鍵酶--β-分泌酶(Beta-site App CleavingEnzyme,BACE1)的抑制劑是AD研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。在AD患者或是動(dòng)物模型腦內(nèi),大量神經(jīng)元持續(xù)破壞的情況下,并
2、沒(méi)有大量神經(jīng)元再生,AD發(fā)生的過(guò)程可認(rèn)為是內(nèi)源性神經(jīng)未能順利再生的過(guò)程?;蚬こ毯透杉?xì)胞移植的研究,給生命科學(xué)帶來(lái)了重大的變革。機(jī)體使NSC進(jìn)入細(xì)胞循環(huán),并誘導(dǎo)其增殖、分化,產(chǎn)生各種神經(jīng)細(xì)胞替代缺損的細(xì)胞,是一種非常有潛力的修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞損傷的手段。NSC具有Aβ?lián)p傷區(qū)的自主追蹤性,移植后的NSC能被特異性吸引到腦內(nèi)神經(jīng)退行性變區(qū)域;然而高濃度的Aβ對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞卻有較強(qiáng)的抑制作用。因此,使AD患者腦部?jī)?nèi)環(huán)境中的Aβ含量降低至一定水平對(duì)
3、于治療AD是及其必要的。隨著RNA干擾(RNA interfererice,RNAi)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,獲得高純度、特異性的siRNA的方法從體外轉(zhuǎn)錄法發(fā)展到體內(nèi)表達(dá)法,本實(shí)驗(yàn)利用體內(nèi)表達(dá)法下調(diào)神經(jīng)干細(xì)胞中:BACE1基因的表達(dá)量,使降低腦內(nèi)Aβ的濃度成為可能;鑒于神經(jīng)元難于轉(zhuǎn)染的特性,下調(diào)了BACE1基因的神經(jīng)干細(xì)胞也可用于誘導(dǎo)并分化為低表達(dá)BACE1基因的神經(jīng)元。這也就是本研究的目的與意義所在。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?在前期對(duì)AD
4、和RNA干擾研究的基礎(chǔ)之上,采用新的siRNA合成技術(shù)----體內(nèi)表達(dá)法,探討RNAi技術(shù)在神經(jīng)干細(xì)胞中特異性下調(diào)BACE1的效果,為利用RNAi技術(shù)靶向BACE1基因治療AD研究的進(jìn)一步開(kāi)展提供重要資料。 材料與方法: 1.構(gòu)建能夠在細(xì)胞內(nèi)采用體內(nèi)表達(dá)生成siRNA的shRNA表達(dá)載體用于RNAi實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建表達(dá)載體的基本步驟是:針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)3條干擾片段,設(shè)計(jì)無(wú)關(guān)序列的對(duì)照作為陰性對(duì)照。合成相應(yīng)的發(fā)夾狀插入DNA片段,并
5、將插入片段連接入pSilenCircle預(yù)切質(zhì)粒。該質(zhì)粒使用基于RNA的U6聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子和優(yōu)的終止子,從而在靶細(xì)胞內(nèi)啟動(dòng)小RNA的轉(zhuǎn)錄。 2.以C17.2小鼠神經(jīng)干細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,將不同質(zhì)量外源GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)C17.2細(xì)胞,觀察質(zhì)粒質(zhì)量對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染率的影響。評(píng)價(jià)GFP質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染時(shí)的劑量--轉(zhuǎn)染率關(guān)系,分析對(duì)于該細(xì)胞系最適合的轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒質(zhì)量。 3.以C17.2小鼠神經(jīng)干細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,將3種重組干擾質(zhì)粒和pGFP-
6、C1質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染進(jìn)C17.2細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下觀察不同實(shí)驗(yàn)組GFP的表達(dá)情況。于干擾后48h提取細(xì)胞總RNA,采用realtime-PCR檢測(cè)不同干擾位點(diǎn)BACE1 mRNA的表達(dá)水平。篩選出干擾效率最高的重組質(zhì)粒。 4.以C17.2小鼠神經(jīng)干細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,將篩選出最有效重組干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)C17.2細(xì)胞系。于干擾后3d、5d、7d提取細(xì)胞總RNA,采用realtime-PCR檢測(cè)BACE1 mRNA的表達(dá)水平。
7、 5.提取新生昆明種小鼠海馬部位神經(jīng)干細(xì)胞并培養(yǎng)鑒定。干擾其BACE1基因并于干擾后3d、5d、7d提取細(xì)胞總RNA,采用Realtime-PCR檢測(cè)BACE1 mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果: 1.構(gòu)建了能夠在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生有效靶向BACE1基因的siRNA的表達(dá)載體。 2.外源GFP質(zhì)??杀怀晒D(zhuǎn)染進(jìn)C17.2細(xì)胞內(nèi),并有效表達(dá)。熒光可在轉(zhuǎn)染后8小時(shí)或更早觀測(cè)到。通過(guò)實(shí)驗(yàn)估算了使轉(zhuǎn)染效率最高的適宜的質(zhì)粒質(zhì)量。
8、 3.體內(nèi)表達(dá)法合成的siRNA有效的抑制了C17.2神經(jīng)干細(xì)胞系BACE1基因的表達(dá)。siRNA對(duì)BACE1的抑制效應(yīng)與靶位點(diǎn)的選擇及干擾位點(diǎn)有關(guān)。干擾后選擇不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),干擾效果在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)可保持恒定。 4.成功提取了新生昆明種小鼠海馬部位的原代神經(jīng)干細(xì)胞并進(jìn)行了鑒定。 5.體內(nèi)表達(dá)法合成的siRNA有效的抑制了原代神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)BACE1基因的表達(dá),干擾效果亦可持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。 結(jié)論: 1.首
9、次自行設(shè)計(jì)合成了針對(duì)BACE1基因的RAN干擾片段,成功構(gòu)建了RNA干擾質(zhì)粒重組體。該重組體可以利用體內(nèi)表達(dá)合成法合成siRNA,避免了目前多采用的體外轉(zhuǎn)錄、化學(xué)合成等方法對(duì)細(xì)胞毒性較大的弊端。重組體通過(guò)感受態(tài)菌體轉(zhuǎn)化等方法可大規(guī)模合成,為大范圍、高通量進(jìn)行RNA干擾研究提供了一種理想的siRNA合成方法。 2.成功將表達(dá)型質(zhì)粒pEGFP-Cl利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入C17.2神經(jīng)干細(xì)胞系。該質(zhì)??稍诩?xì)胞內(nèi)表達(dá)外源性GFP基因。隨著pE
10、GFP-Cl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染劑量的增加,轉(zhuǎn)染效率先升高后降低,提示轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的劑量是保證轉(zhuǎn)染效率的必要條件。在C17.2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染最佳劑量該質(zhì)粒后,轉(zhuǎn)染效率>90﹪,外源基因GFP表達(dá)持續(xù)時(shí)間>84小時(shí),為使用RNA干擾質(zhì)粒重組體高效轉(zhuǎn)染C17.2神經(jīng)干細(xì)胞并在其內(nèi)持續(xù)表達(dá)靶向BACEl基因的siRNA提供了理論依據(jù)。 3.利用體內(nèi)表達(dá)法針對(duì)BACE1基因,將質(zhì)粒重組體和pEGFP-Cl質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染C17.2神經(jīng)干細(xì)胞,成功抑制了其中內(nèi)源性
11、BACE1基因的表達(dá),抑制作用呈現(xiàn)出位點(diǎn)效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。通過(guò)檢測(cè)成功篩選出一條靈敏度高特異性強(qiáng)的靶向:BACE1基因的siRNA序列,其重組體干擾效果可達(dá)7天以上。提示RNA干擾后C17.2神經(jīng)干細(xì)胞可作為基因治療AD的理想的細(xì)胞株。 4.從新生昆明種小鼠海馬組織細(xì)胞中成功提取了原代神經(jīng)干細(xì)胞,經(jīng)體外培養(yǎng)分裂增殖成由數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成的神經(jīng)球。Nestin免疫熒光染色證實(shí)神經(jīng)干細(xì)胞純度高,GFAP和β-tublin免疫熒光染色證實(shí)神
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