玉米脆稈突變體基因初定位及芒草農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因體系初探.pdf

1、第一章玉米脆稈突變體基因初定位
　　玉米秸稈不僅作為生物質(zhì)能源的重要原材料，在飼料以及其他生物與工業(yè)產(chǎn)品中也占有極其重要的地位。脆稈突變體是研究細(xì)胞壁形成機(jī)制以及對(duì)細(xì)胞壁改良的重要資源。本實(shí)驗(yàn)自交系Zong31和帶有Mu轉(zhuǎn)座活性的自交系W22交雜構(gòu)建的突變體庫中，篩選得到了莖稈和葉片都明顯表現(xiàn)為脆性的突變體植株，命名為Y04，經(jīng)多代自交和表型的鑒定，獲得了穩(wěn)定的純合突變體。本研究應(yīng)用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、和遺傳學(xué)等方法分析了此突變體與正

2、常玉米的莖稈穿刺力、成熟期生物學(xué)性狀的測(cè)定、成熟期莖稈的顯微結(jié)構(gòu)、秸稈細(xì)胞壁成分的差異、纖維素影響因子的測(cè)定，并將引起脆性表型的基因br(brittle stalk)進(jìn)行了初步定位。為今后深入研究脆性基因的克隆、功能的分析以及生物質(zhì)能源利用等提供了材料和理論基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　1)田間表型觀測(cè):在種子萌發(fā)和幼苗階段，突變體和正常玉米植株生長(zhǎng)情況并無差異。在突變體生長(zhǎng)約至4周即四葉一心期時(shí)，開始出現(xiàn)脆性，所有器官均表現(xiàn)為脆性，

3、且整個(gè)生育期持續(xù)存在。
　　2)突變體的莖稈與Zong31相比，組織韌性和穿刺力強(qiáng)度減弱，極其容易被折斷。莖稈穿刺力測(cè)定結(jié)果表明:脆性植株莖稈的穿刺力較Zong31和Mu有極顯著降低，分別降低了46.1％和68.5％。
　　3)徒手切片染色結(jié)果顯示:脆性植株莖稈維管束數(shù)目、分布及皮層周圍細(xì)胞層數(shù)與正常植株差異不大。主要是維管束細(xì)胞的纖維素含量降低，木質(zhì)素含量升高。掃描電鏡觀測(cè)顯示:突變體維管束鞘細(xì)胞厚壁組織細(xì)胞壁厚度明顯變薄

4、，排列疏松。
　　4)莖稈細(xì)胞壁化學(xué)成分測(cè)定的結(jié)果表明:脆稈突變體中，纖維素含量占干物質(zhì)總量的12.77％，極顯著低于正常植物的31.2％;纖維素結(jié)晶度極顯著低于Zong31的21.5％;淀粉含量占干物質(zhì)總量的0.75％，顯著性低于Zong31的24.2％;可溶性糖含量占干物質(zhì)總量的33.56％，顯著性高于Zong31的18.6％。半纖維素略有下降，木質(zhì)素和果膠含量略有升高，均較對(duì)照差異不明顯。
　　5) Y04脆性基因br

5、(brittle stalk)克隆結(jié)果顯示與bk2并不相同，在Zong31背景下較br與bk2有多處單堿基缺失，在1472-1557之間有幾處較大缺失，對(duì)缺失片段進(jìn)行群體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)并不是由此缺失引起表型的改變。
　　6)2013年秋天在武漢實(shí)驗(yàn)基地種植的F1單株，田間表型正常;2015年春天漢川實(shí)驗(yàn)基地種植的約1500株單株F2群體中正常和脆性植株的分離比為1150∶244，損失脆稈約為106株，符合3∶1分離比。圖位克隆方法將br

6、基因定位在9號(hào)染色體上，鎖定在bnlg1159和umc1771之間，且br與umc1120和umc2121共分離，目標(biāo)基因br距離umc2398和umc1771最近，遺傳距離分別是11.5cM和3.1cM，說明目標(biāo)基因br更靠近umc1771標(biāo)記。
　　第二章芒草農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因體系初探
　　芒（Miscanthus sinensis）是自然界中分布最為廣泛的芒屬物種，它是目前國(guó)際上研究最為熱門的三倍體交雜種芒草-巨芒(M.

7、×giganteus)其中的二倍體親本，是開展遺傳改良的遺傳種質(zhì)基礎(chǔ)。新品種的選育是大面積種植和利用芒屬能源植物需要解決的首要問題，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是進(jìn)行遺傳改良最有效的途徑之一，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化以其成本低、轉(zhuǎn)化效率高、易操作等優(yōu)勢(shì)被廣泛的應(yīng)用到外源基因?qū)氲绞荏w細(xì)胞的過程中去。本研究以芒的幼穗作為外植體誘導(dǎo)胚性愈傷作為受體材料，研究了以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法為基礎(chǔ)，活性炭，農(nóng)桿菌菌液濃度，乙酰丁香酮濃度的差異，表面活性劑，超聲波處

8、理等對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。其主要的結(jié)果如下:
　　1)在誘導(dǎo)15天的培養(yǎng)過程中，沒有添加活性炭(AC)的培養(yǎng)基褐化嚴(yán)重;在添加了0.2％AC的培養(yǎng)基中，褐化并不明顯。
　　2)統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)80天后，愈傷在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)，沒有添加活性炭的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷較添加了0.2％活性炭的培養(yǎng)基要多。沒有添加活性炭(AC)培養(yǎng)基的出愈率為79.0％，而添加了0.2％AC的培養(yǎng)基的出愈率為38.9％。
　　3)不同農(nóng)桿菌菌液OD60

9、0和時(shí)間組合侵染胚性愈傷，并將轉(zhuǎn)化后的愈傷分別經(jīng)過第一次選擇和第二次選擇后，只有OD600=0.7，侵染30min這個(gè)組合下的愈傷，在經(jīng)過兩次篩選后有存活下來的愈傷。故農(nóng)桿菌菌液OD600=0.7，侵染30min為最佳組合。
　　4)超聲波在農(nóng)桿菌侵染愈傷過程中的處理，在侵染過程中利用超聲波分別處理0、2、4、8、300、600、1200s后，將愈傷接種到一選培養(yǎng)基上，0、2、4、8s處理過的愈傷均全部死亡，而經(jīng)過300、600、