馬鈴薯Y病毒HC-Pro基因及其突變體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植株抗病性研究.pdf

1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文馬鈴薯Y病毒HCPro基因及其突變體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植株抗病性研究姓名：崔海濤申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：植物病理指導(dǎo)教師：李向東20050520山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩=學(xué)位論丈摘要馬鈴薯Y病毒編碼的輔助成分蛋白酶(HC—Pro)具有多種功能，如蛋白酶活性、病毒移動、抑制基因沉默和輔助蚜蟲傳毒功能等。在本研究中，通過PCR方法，獲得了該基因的三個缺失突變體，連同完整基因構(gòu)建了四種植物表達載體，通過土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化了煙草品種N

2、C89。對這四種轉(zhuǎn)基因植物進行了抗病性、分子生物學(xué)及生物學(xué)鑒定和比較。在細菌菌株BL21中表達了HC—Pro基因和一個突變體，并用原核表達的蛋白免疫家兔制備了抗血清。具體結(jié)果如下：1以本實驗室分離克隆的PVY“HCPro基因為模板，設(shè)計突變體引物，通過PCR獲得可翻譯C端區(qū)域(HC—C，598bp)，非翻譯C端區(qū)域(HC—C’，599bp)，缺失中間區(qū)域的可翻譯HC(HC—NC，1003bp)3個缺失突變體。將全長HC基因和3個突變體片

3、段克隆到載體pucl8的BamHI和Kpnl之間，并經(jīng)過序列測定證實。分別用BamHI和Kpnl從重組克隆載體上將全長HC基因和各突變體片斷切下，插入植物表達載體pROKIl35S啟動子下游，構(gòu)建了4個植物表達載體pROKC、pROK—C’、pROK—NC和pROKHC，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后用于普通煙的轉(zhuǎn)化。2通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含有外源基因的土壤農(nóng)桿菌LBA4404和普通煙草NC89葉盤共培養(yǎng)，在含有卡那霉素的MS培養(yǎng)基中選擇，獲得了轉(zhuǎn)基因的煙

4、草植株，通過PCR檢測證明分別獲得HC—C、HC—C’、HCNC和HC轉(zhuǎn)基因煙草12l、116、124和130株。3用PVY“對轉(zhuǎn)基因植株攻毒，兩周后，第一次接毒不發(fā)病的植株進行二次攻毒，再過兩周后BLIsA檢測植株內(nèi)病毒濃度。結(jié)果表明從用C、C’、NC和全長HC轉(zhuǎn)化的植株中分別獲得抗病植株6、15、8和3棵。4饑餓2h的桃蚜在推遲發(fā)病型植株上取食5分鐘后，轉(zhuǎn)移到非轉(zhuǎn)基因植株上，進行傳病毒實驗。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)HCN、HCNC基因(轉(zhuǎn)HC—