抑制差減雜交分析嗜水氣單胞菌可能的毒力基因及gneJ基因的克隆表達(dá)與活性分析.pdf

1、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)是一類廣泛存在于水環(huán)境的機(jī)會(huì)致病菌，它不僅能引發(fā)多種水生動(dòng)物的傳染病，而且也是爬行類、兩棲類、鳥類等動(dòng)物的重要病原菌。抑制性差減雜交(SSH)一種以抑制性PCR為基礎(chǔ)的尋找差異表達(dá)基因的方法，是細(xì)菌基因組比較，病原體中未知基因的篩選乃至分子進(jìn)化分析的重要研究手段． 1．采用抑制差減雜交技術(shù)(Suppression subtractive hybridization，S

2、SH)對(duì)嗜水氣單胞菌強(qiáng)毒株J-1株與弱毒株MR-1株進(jìn)行了基因組差異片段克隆與分析。共檢出21個(gè)特異性差異片段，其中18個(gè)差異片段與氣單胞菌及弧菌屬基因有較高同源性，包括：黏附相關(guān)序列、調(diào)控序列、細(xì)胞分化序列、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列等，另外3個(gè)差異片段未發(fā)現(xiàn)有同源片段。結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌強(qiáng)毒株與弱毒株基因組間存在較多差異基因，為檢測(cè)嗜水氣單胞菌毒力株等奠定了良好的基礎(chǔ)。 2．通過Ah強(qiáng)毒株J-1、弱毒株MR-1之間的抑制性差減雜交(S

3、SH)，選取其中4個(gè)可能與Ah毒力相關(guān)的片段，分別為與LPS生物合成及毒力作用有關(guān)的gne差向異構(gòu)酶，調(diào)節(jié)毒力基因表達(dá)的BvgS因子，二硫化物結(jié)合蛋白異構(gòu)酶DsbC，調(diào)理吞噬作用的FtsY基因。根據(jù)這4個(gè)片段的序列，設(shè)計(jì)了4對(duì)引物，用PCR方法對(duì)不同來源、不同毒力的22株嗜水氣單胞菌進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，此4對(duì)引物中有3對(duì)可以有效地將致病株及無毒力株區(qū)分開來。此結(jié)果將有助于嗜水氣單胞菌檢測(cè)方法的建立。 3．用PCR擴(kuò)增了Ah J

4、-1株完整的gneJ基因，將其克隆至質(zhì)粒pET32a(+)，在大腸桿菌BL21中進(jìn)行異源表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示重組表達(dá)蛋白的分子量約59.7kD，與理論推測(cè)值基本相同。酶活性分析表明該重組蛋白可將UDP-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)化為UDP-乙酰半乳糖胺，確證gneJ基因編碼蛋白為UDP-乙酰葡萄糖胺-4-差向異構(gòu)酶。Westernblot分析顯示Ah J-1胞外產(chǎn)物的兔抗血清可識(shí)別該重組蛋白，表明該蛋白與天然蛋白有相同的抗原性，以重組蛋白