shRNA介導(dǎo)的RNA干擾對(duì)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞COX-2表達(dá)的抑制作用研究.pdf

1、目的：探討針對(duì)環(huán)氧化酶-2(COX-2)的RNA干擾(RNAi)對(duì)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞中COX-2及基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)表達(dá)的影響。 方法：體外培養(yǎng)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞，測(cè)定陽(yáng)離子脂質(zhì)體HiperFect TransfectionReagent介導(dǎo)的siRNA在兔角膜基質(zhì)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染率，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。設(shè)計(jì)并合成3條針對(duì)兔COX-2基因的短發(fā)卡RNA(shRNA-1，2，3)和一條陰性對(duì)照shRNA。利用24孔板接種兔角膜基質(zhì)細(xì)胞

2、，隨機(jī)分為A、B、C、D、E、F六組，每組各10個(gè)孔，每個(gè)孔中接種細(xì)胞數(shù)目約為6×10<'-4>。A組為空白對(duì)照組，B、C、D、E、F為實(shí)驗(yàn)組，其中B組接種細(xì)胞后36小時(shí)每ml培養(yǎng)液加入25ng IL-1α，C、D、E、F組接種細(xì)胞后24小時(shí)每個(gè)細(xì)胞孔(含0.5ml無血清DMEM培養(yǎng)液)內(nèi)加入3.0μl HiPerFectTransfection Reagent和25nM不同shRNA(分別為shRNA-1、shRNA-2、shRNA-

3、3及陰性對(duì)照shRNA)的稀釋混合物，12小時(shí)后每ml培養(yǎng)液再加入25ng IL-1α。在IL-1α處理6h、12h、24h、48h、72h時(shí)隨機(jī)選取每組中兩個(gè)培養(yǎng)孔的細(xì)胞，提取RNA，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)檢測(cè)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞中COX-2和MMP-2基因的表達(dá)，并與對(duì)照組進(jìn)行比較。 結(jié)果： HiperFect Transfection Reagent能夠有效介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的兔角膜基質(zhì)細(xì)

4、胞，轉(zhuǎn)染率可達(dá)70-80％。IL-1α刺激后兔角膜基質(zhì)細(xì)胞中COX-2及MMP-2mRNA的表達(dá)較空白對(duì)照組顯著升高，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性；在不同的時(shí)間點(diǎn)，生物合成的三條針對(duì)COX一2的靶向shRNA中shRNA-2能顯著抑制IL-1α刺激后的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞中COX-2、MMP-2 mRNA表達(dá)，抑制率最高可分別達(dá)83.04％、73.69％，與單純IL-1α刺激組相比差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而shRNA-1、shRNA-3轉(zhuǎn)