多靶位RNA干擾對HIV-1抑制作用的研究.pdf

1、人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是能引發(fā)人體發(fā)生獲得性免疫缺陷綜合癥即“艾滋病”的病原體。自1981年發(fā)現(xiàn)以來，艾滋病及HIV感染已成為一個世界性的難題。目前還沒有任何有效的疫苗來預(yù)防HIV的感染，藥物治療仍是治療艾滋病最有效的方法。藥物引發(fā)對人體的副作用和某些耐藥HIV病毒株的出現(xiàn)已經(jīng)成為艾滋病藥物治療的最大困擾。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于抑制

2、多種病毒(如HIV)的基因表達(dá)和感染的研究中。由于HIV-1病毒基因組的高突變性，單一的siRNA不能長期抑制HIV-1病毒的復(fù)制。為了解決這一問題，可以將RNAi的作用靶點選擇在HIV-1病毒基因的高度保守區(qū)，同時進(jìn)行多個RNAi靶點的聯(lián)合抑制。這種聯(lián)合抑制可以減少HIV-1逃脫RNA干擾的機(jī)率，達(dá)到持久的抑制效果。開展HIV-1的RNAi對艾滋病的預(yù)防和基因治療都有著重要的實用價值。
　　本研究以RNAi為主線，從vpu-RN

3、Ai與宿主抗病毒因子tetherin的聯(lián)合抑制，特定HIV-1人群的gag基因的單基因RNAi和多靶位RNAi三個方面來驗證RNAi對HIV-1病毒的抑制效果。
　　Vpu是HIV-1特有的蛋白，它可以拮抗宿主抗病毒蛋白tetherin對病毒顆粒的束縛作用。為了消弱Vpu的拮抗作用并增強(qiáng)tetherin的抗病毒作用，我們采取了vpu-RNAi與tetherin過表達(dá)的方式聯(lián)合抑制HIV-1的策略。在TZM-bl細(xì)胞中，首次采用2種

4、慢病毒載體聯(lián)合抑制HIV-1的復(fù)制。在具體實驗過程中，我們以表達(dá)vpu-siRNA和tetherin的兩種慢病毒以不同比例進(jìn)行聯(lián)合抑制HIV-1。經(jīng)過對感染HIV-1的TZM-bl細(xì)胞中的Luciferase測定，vpu-siRNAi對HIV-1激活的luciferase活性抑制效率最高。實驗結(jié)果證明單一siRNA可以達(dá)到比聯(lián)合抑制更好的抑制效果。
　　HIV-1有多種病毒亞型，并且該病毒在不同地區(qū)和人群中的傳播和流行情況也不一樣

5、。在確認(rèn)了單一siRNA的抑制效果后，我們又以天津地區(qū)男男同性戀感染HIV-1人群的HIV-1 gag基因為RNAi靶點，探討gag-siRNAi對特定HIV-1人群的抑制水平。通過對44條來自天津MSM HIV-1感染者的gag基因序列分析，我們找出了序列保守位點，并設(shè)計了5個shRNA(gag-shRNA-1～5)。通過對gag-EGFP融合基因的抑制水平，確認(rèn)了gag-shRNA-3對不同亞型的gag基因和HIV-1 B/C兩種亞

6、型的感染性克隆都有較高的抑制能力。
　　在確認(rèn)單一siRNA(vpu-siRNA和gag-siRNA)都有抑制效果的情況下，我們同時選取了HIV-1的結(jié)構(gòu)基因(gag，env)、調(diào)控基因(tat)和輔助基因(vpu)作為RNAi的靶點。通過表達(dá)多個小干擾RNA(siRNA)的表達(dá)原件——dlhRNA(double long hairpin RNA)來實現(xiàn)HIV-1的多靶位抑制。本研究以含靶點序列的HIV-1基因和綠色熒光蛋白融合系

7、統(tǒng)來檢測RNAi的抑制效率。實驗中分別構(gòu)建了4個表達(dá)單個siRNA的短發(fā)夾RNA(shRNA)，8個同時表達(dá)兩個siRNA的長發(fā)夾RNA(lhRNA)和2個同時表達(dá)四個siRNA的雙長發(fā)夾RNA(dlhRNA)。最后得到了抑制效果最好的雙長發(fā)夾RNA表達(dá)原件dlhRNA-VGTE，并將dlhRNA表達(dá)原件導(dǎo)入FG12慢病毒載體。在TZM-bl細(xì)胞中，經(jīng)過持續(xù)加入FG12-VGTE病毒(MOI=0.04)可以完全抑制HIV-1病毒的復(fù)制。