乙型肝炎病毒大蛋白與HBV DNA的相關(guān)性及其致病機(jī)制的初步研究.pdf

1、乙型肝炎病毒大蛋白(large surface proteins of hepatitis B virus，LHBs)是唯一一種具有雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、致肝細(xì)胞毒性、反式激活增強(qiáng)病毒復(fù)制作用的乙型肝炎病毒包膜蛋白，廣受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。由于LHBs具有細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)滯留性，在體外難以表達(dá)，表達(dá)過程中又極易降解，因此將LHBs作為一個(gè)整體來進(jìn)行功能研究相對(duì)較少。近年來，通過蛋白修飾等技術(shù)，已經(jīng)可以在體外完整表達(dá)并純化出LHBs，從而使LHBs相關(guān)功能研

2、究成為可能。 目前臨床上通常以HBeAg來判斷乙肝病毒復(fù)制及傳染性強(qiáng)弱，但當(dāng)乙肝病毒發(fā)生前C與C區(qū)變異后，會(huì)出現(xiàn)HBeAg陰性而病毒仍保持復(fù)制狀態(tài)的情況，造成臨床難以根據(jù)HBeAg確定治療時(shí)機(jī)。在抗病毒治療過程中，血清HBV DNA拷貝數(shù)的下降是評(píng)估其療效的主要指標(biāo)，但由于核苷類抗病毒藥物只能抑制HBVDNA復(fù)制，并不能抑制已經(jīng)形成的病毒以其DNA為模板的轉(zhuǎn)錄和病毒蛋白的表達(dá)，故認(rèn)為在監(jiān)測病毒復(fù)制、觀察治療效果上僅僅采用HBeA

3、g和HBV DNA指標(biāo)是不夠的，有必要增加具有反式激活病毒復(fù)制功能和直接對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生毒性蛋白的蛋白因子檢測，對(duì)于這個(gè)指標(biāo)，LHBs是適合的。 HBV能夠感染肝細(xì)胞的關(guān)鍵是HBV和肝細(xì)胞表面受體結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)LHBspre-S區(qū)在空間上具有獨(dú)特的雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，在包膜內(nèi)側(cè)可以和HBV核衣殼結(jié)合，外側(cè)可與易感細(xì)胞受體結(jié)合，而究竟HBV與何種肝細(xì)胞表面受體結(jié)合以及結(jié)合后HBV是如何進(jìn)入肝細(xì)胞的，有待進(jìn)一步研究。另外兩種包膜蛋白的功能研究

4、發(fā)現(xiàn)，pre-S1蛋白參與HBsAg的運(yùn)輸與分泌，pre-S2則介導(dǎo)HBV粘附人肝細(xì)胞，此二者被作為HBV一個(gè)新的具有傳染性和復(fù)制的標(biāo)志物，可能參與了HBV肝細(xì)胞內(nèi)的裝配及分泌?；谑删w表面展示的高通量篩選是目前尋找靶蛋白結(jié)合肽的優(yōu)選策略，已被廣泛應(yīng)用到配體-受體關(guān)系的研究之中。我們擬采用噬菌體展示的方法，以三種HBV包膜蛋白為靶蛋白，尋找可能與之相結(jié)合的肝細(xì)胞表面受體蛋白。然后利用RNAi技術(shù)，敲除肝細(xì)胞表面特異性受體蛋白，觀察對(duì)H

5、BV感染肝細(xì)胞的影響，以此來證實(shí)該蛋白是HBV入侵肝細(xì)胞的關(guān)鍵受體蛋白。為此，我們首先收集200例慢性HBV感染者的血清，檢測HBV LMBs、HBeAg與HBV DNA拷貝數(shù)的關(guān)聯(lián)性；同時(shí)，應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選出可能與三種HBV包膜蛋白相結(jié)合的肝細(xì)胞膜蛋白，進(jìn)而通過RNA干擾來驗(yàn)證其是否為肝細(xì)胞表面與HBV包膜蛋白確實(shí)相結(jié)合的蛋白。主要研究內(nèi)容和研究結(jié)果如下： 一、乙肝病毒大蛋白與HBeAg、HBV DNA的相關(guān)性研究目的：

6、檢測LHBs、HBeAg與HBV DNA拷貝數(shù)的關(guān)聯(lián)性，以期尋找對(duì)病毒的復(fù)制、療效判斷更為敏感的指標(biāo)。方法：收集200例慢性HBV感染者血清，應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測HBV DNA含量，ELISA法檢測LHBs和HBeAg含量。采用卡方檢驗(yàn)和方差分析對(duì)血清LHBs水平與HBV DNA對(duì)數(shù)值和HBeAg含量之間相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果：200例慢性HBV感染者中，HBV DNA陽性率為52.5﹪(105/200)，LMBs陽性率為55﹪(

7、110/200)(X<'2>=0.72，P>0.05)；HBeAg陽性率為54.5﹪(109/200)；LHBs含量與HBV DNA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值之間有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)(r=0.935，P<0.01．)，方差分析顯示不同HBV DNA拷貝數(shù)組之間，LHBs含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=136.0，P<0.01)。結(jié)論：血清LFIBs和HBV DNA協(xié)同檢測更能代表HBV病毒復(fù)制，并有望成為乙肝治療療效判定和治療時(shí)機(jī)評(píng)定指標(biāo)。 二

8、、噬菌體表面展示技術(shù)篩選乙肝病毒大蛋白結(jié)合蛋白目的：篩選LHBs在正常肝細(xì)胞表面的結(jié)合蛋白。方法：以純化的LHBs為固相篩選蛋白，用正常人肝細(xì)胞的噬菌體T7 cDNA文庫進(jìn)行5輪生物篩選，經(jīng)噬斑PCR，挑選片段長度不一的克隆，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(EMSA)驗(yàn)證所篩選出結(jié)合蛋白，然后對(duì)其DNA序列進(jìn)行測序，將所得DNA序列相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列在GenBank中搜索，確定可能與IMBs相結(jié)合的蛋白。結(jié)果：經(jīng)ELISA驗(yàn)證獲得35個(gè)陽性克隆，

9、經(jīng)同源搜索，初步確定22個(gè)可能與LHBs相結(jié)合的肝細(xì)胞表面蛋白，其中包括人類去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)、人類輔助蛋白5受體等22個(gè)已知蛋白，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)9個(gè)未知功能蛋白。結(jié)論：發(fā)現(xiàn)了31個(gè)可能與IMBs結(jié)合的肝細(xì)胞表面蛋白，為進(jìn)一步研究與IHBs特異性結(jié)合的蛋白提供基礎(chǔ)。 三、噬菌體表面展示技術(shù)篩選pre-S1、pre-S2蛋白結(jié)合蛋白目的：尋找乙型肝炎病毒pre-S1、pre-S2蛋白結(jié)合蛋白。方法：分別以純化的HBV p

10、re-S1、pre-S2蛋白為固相篩選蛋白，用正常人肝細(xì)胞的噬菌體T7 cDNA文庫進(jìn)行5輪生物篩選，經(jīng)噬斑PCR，挑選片段長度不一的克隆，應(yīng)用ELISA驗(yàn)證所篩選出結(jié)合蛋白，然后對(duì)其DNA序列進(jìn)行測序，將所得DNA序列相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列在GenBank中搜索，確定可能與HBV pre-S1、pre-S2蛋白相結(jié)合的蛋白。結(jié)果：ELISA分別測定篩選的pre-S1與pre-S2蛋白噬斑裂解液與噬菌體抗體結(jié)合的活性，經(jīng)同源性搜索，初步確定

11、pre-S1結(jié)合蛋白25個(gè)，pre-S2結(jié)合蛋白15個(gè)?？赡芘cHBV pre-S1相結(jié)合的蛋白包括人體載脂蛋白H，PI-3激酶相關(guān)激酶SMG-1同類蛋白等22個(gè)已知蛋白，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)3個(gè)未知功能蛋白；與HBV pre-S2相結(jié)合的蛋白包括細(xì)胞色素P450 Ⅰ類A型亞基克隆2個(gè)、PI-3激酶相關(guān)激酶SMG-1同類蛋白3個(gè)、細(xì)胞生長抑制蛋白42有2個(gè)、膜聯(lián)蛋白A11轉(zhuǎn)錄變異體有1個(gè)、轉(zhuǎn)錄激活因子5有3個(gè)、α酸性糖蛋白有2個(gè)、未知功能蛋白2個(gè)。

12、結(jié)論：發(fā)現(xiàn)了25個(gè)可能與HBV pre-S1蛋白相結(jié)合的肝細(xì)胞表面蛋白，15個(gè)可能與HBV pre-S2蛋白相結(jié)合的肝細(xì)胞蛋白，為進(jìn)一步研究HBV入侵肝細(xì)胞途徑提供新思路。 四、去唾液酸糖蛋白受體shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及初步功能鑒定目的：證實(shí)ASGPR為HBV入侵肝細(xì)胞的關(guān)鍵受體。方法：利用RNA干擾技術(shù)，設(shè)計(jì)合成靶向ASGPR的shRNA寡核苷酸序列，將其克隆至帶有U6啟動(dòng)子的Pgenesil-1真核表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒