乙型肝炎病毒X基因在乙型病毒相關(guān)性腎炎中的致病作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 為了進(jìn)一步明確HBx基因在乙肝病毒相關(guān)性腎小球腎炎中的致病作用及相關(guān)機(jī)制，我們通過(guò)對(duì)22例HBV-GN患者的腎活檢組織中腎小管上皮細(xì)胞的凋亡、凋亡相關(guān)蛋白及HBx表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析;通過(guò)構(gòu)建真核表達(dá)載體將HBx基因轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中，探討HBx基因?qū)δI小管上皮細(xì)胞的增殖和凋亡的影響，為乙肝病毒相關(guān)性腎炎分子機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法對(duì)22例H

2、BV-GN患者及5例對(duì)照組腎組織分別檢測(cè)HBx、p-STAT3、STAT3、Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)
　　 2、采用TUNEL標(biāo)記法檢測(cè)22例HBV-GN患者及5例對(duì)照組腎組織中腎小管上皮細(xì)胞的凋亡
　　 3、分析22例HBV-GN患者腎組織中腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)與HBx表達(dá)、患者臨床蛋白尿及HBVDNA定量的相關(guān)性
　　 4、HBx基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1-HBx的構(gòu)建和鑒定
　　 從He

3、pG2.2.15細(xì)胞中提取總RNA，以總RNA為模板，采用RT-PCR方法擴(kuò)增目的基因HBx(464bp)，將后者克隆到載體pcDNA3.1(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HBx。后者通過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α、提取、電泳、測(cè)序以及酶切等方法進(jìn)行鑒定。
　　 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDNA3.1-HBx轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，并用WB法檢測(cè)目的蛋白HBx的表達(dá)。
　　 5、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率
　　 收集

4、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔板，每孔100ul。細(xì)胞貼壁后，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒及pc-DNA3.1-HBx，并設(shè)對(duì)照組。細(xì)胞在37℃，飽和濕度、5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h、72h。CCK-8法檢測(cè)各孔吸光度值（OD值），計(jì)算細(xì)胞生存率及增殖抑制率。
　　 6、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔板。細(xì)胞貼壁后，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒及pc-DNA3.1-HBx，并設(shè)對(duì)照組及AG490干預(yù)

5、組。細(xì)胞在37℃，飽和濕度、5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h、72h。消化收集各組細(xì)胞，Annexin V-FITC/PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡百分比。
　　 7、共聚焦熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)
　　 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔板。細(xì)胞貼壁后，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒及pc-DNA3.1-HBx，并設(shè)對(duì)照組。在37℃，飽和濕度、5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h、72h。固定細(xì)胞后，Hoechst3

6、3342熒光染料染色，共聚焦熒光顯微鏡觀(guān)察、攝片。
　　 8、透射電鏡觀(guān)察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)
　　 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔板。細(xì)胞貼壁后，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒及pc-DNA3.1-HBx，并設(shè)對(duì)照組。細(xì)胞在37℃，飽和濕度、5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h、72h。消化收集各組細(xì)胞，置于2.5％戊二醛中固定。制成超薄切片，于透射電鏡下觀(guān)察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。
　　 9、細(xì)胞免疫熒光/免疫化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞JAK2、S

7、TAT3、p-STAT3及Bcl-2、Bax的表達(dá)
　　 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔板或12孔板中爬片。細(xì)胞貼壁后，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒及pc-DNA3.1-HBx，并設(shè)對(duì)照組及AG490干預(yù)組。細(xì)胞在37℃，飽和濕度、5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、48h、72h。細(xì)胞固定后，細(xì)胞免疫熒光/免疫化學(xué)法檢測(cè)JAK2、STAT3、p-STAT3及Bcl-2、Bax的表達(dá)，顯微鏡下觀(guān)察、攝片。
　　 10、Western

8、 blot方法檢測(cè)JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3及Bcl-2、Bax的表達(dá)
　　 收集各組細(xì)胞，提取蛋白，用Western blot方法檢測(cè)JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3及Bcl-2、Bax的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、兩組患者腎組織HBx、p-STAT3、STAT3、Bax及Bcl-2的表達(dá)
　　 86％(19/22)的HBV-GN患者腎組織內(nèi)存在不同程度的H

9、Bx表達(dá)，其主要分布于腎小管上皮細(xì)胞胞漿，腎小球內(nèi)也有少數(shù)分布。與對(duì)照組比較，HBV-GN中STAT3、p-STAT3表達(dá)明顯增強(qiáng)，Bax表達(dá)亦明顯增加，而B(niǎo)cl-2表達(dá)明顯下降(均P＜0.05)。
　　 2、兩組患者腎組織腎小管上皮細(xì)胞的凋亡
　　 HBV-GN患者腎組織可見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，凋亡指數(shù)為（16.82±3.35％），少數(shù)腎小球內(nèi)也可見(jiàn)凋亡細(xì)胞。對(duì)照組腎組織極少見(jiàn)凋亡細(xì)胞。
　　 3、HBV-GN

10、患者腎組織腎小管上皮細(xì)胞的凋亡指數(shù)與HBx表達(dá)、臨床蛋白尿及HBV-DNA的相關(guān)性
　　 HBV-GN組患者腎小管上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)與腎臟HBx表達(dá)有顯著相關(guān)性(r=0.612，P=0.032)。凋亡指數(shù)與24h蛋白尿有顯著相關(guān)性(r=0.824，P=0.020)。凋亡指數(shù)與HBV-DNA復(fù)制量無(wú)顯著相關(guān)性(P=0.738)。
　　 4、HBx基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1-HBx的構(gòu)建和鑒定
　　 測(cè)序分析顯示

11、:HBx編碼基因與Genbank發(fā)表的序列相符(ID:944566)。pcDNA3.1-HBx經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切釋出插入子，與HBx基因(464bp)大小相一致。
　　 pcDNA3.1-HBx轉(zhuǎn)染腎小管上皮細(xì)胞24h后，Western blot分析顯示，有分子量為17kD的HBx蛋白表達(dá)，72h達(dá)高峰。
　　 5、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率
　　 轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細(xì)胞存活率與對(duì)照組無(wú)明顯差別，提示對(duì)

12、細(xì)胞無(wú)明顯增殖抑制作用(P＞0.05)。轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx24h后，對(duì)細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，達(dá)到（14.08±2.14）％。轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx48h后，細(xì)胞的增殖抑制率顯著增加，達(dá)到(31.33±2.24)％。轉(zhuǎn)染72h后，細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到(35.27±1.10)％，與24h有顯著增加(P＜0.05)，但與48h無(wú)明顯差別(P＞0.05)。
　　 6、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　 轉(zhuǎn)染空質(zhì)

13、粒組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05);轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx24小時(shí)組細(xì)胞的凋亡率為（15.12±1.98）％;轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx48小時(shí)組細(xì)胞的凋亡率（20.62±2.23）％;pc-DNA3.1-HBx72小時(shí)組細(xì)胞的凋亡率為（23.80±2.16）％。轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx后各組細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組組均顯著增高，差異具有顯著性(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)較轉(zhuǎn)染24小時(shí)組凋亡率顯著增高，差異

14、有顯著性(P＜0.05)。但轉(zhuǎn)染后48小時(shí)與轉(zhuǎn)染后72小時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。AG490干預(yù)組凋亡率為（14.34±2.63）％，與未干預(yù)組有顯著差別(P＜0.05)。
　　 7、共聚焦熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)
　　 對(duì)照組及轉(zhuǎn)空質(zhì)粒組細(xì)胞核形態(tài)正常;轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBx質(zhì)粒24h、48h、72h組均可見(jiàn)細(xì)胞核呈波紋狀或呈折縫樣，細(xì)胞核染色質(zhì)呈高度凝聚，核碎裂等。
　　 8、透射電鏡觀(guān)察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)
　　

15、 對(duì)照組及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細(xì)胞核近于圓形，核仁偏位存在，核膜清晰。HBx24h組、48h組、72h組:核仁不規(guī)則，有凹陷，核膜水腫，核內(nèi)異染色質(zhì)凝聚、邊集。
　　 9、細(xì)胞免疫熒光/免疫化學(xué)檢測(cè)JAK2、STAT3、p-STAT3及Bcl-2、Bax的表達(dá)
　　 在對(duì)照組中，JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白均主要表達(dá)于胞漿，且p-STAT3蛋白表達(dá)很弱;轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx24小時(shí)組后p-STAT3蛋白水平

16、明顯增加，在72h時(shí)表達(dá)水平最高;轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx24小時(shí)后，總JAK2及STAT3蛋白水平亦明顯增加，在72小時(shí)達(dá)高峰，主要在胞漿表達(dá)。在對(duì)照組中，Bcl-2有較高水平表達(dá)。轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx24小時(shí)組后Bcl-2表達(dá)水平有所下降，在72h表達(dá)水平降至最低。Bax在對(duì)照中腎小管上皮細(xì)胞中有少量表達(dá);轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx24小時(shí)組后Bax表達(dá)水平有所上升，在72h在胞漿呈現(xiàn)高水平表達(dá)。AG490干預(yù)后

17、，p-STAT3、STAT3及JAK2表達(dá)水平均有所下降。
　　 10、Western blot方法檢測(cè)JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3及Bcl-2、Bax的表達(dá)
　　 對(duì)照組細(xì)胞中JAK2及STAT3有少量磷酸化，轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx24h后，p-JAK2及p-STAT3的表達(dá)均明顯增高;總JAK2及STAT3表達(dá)也明顯增高，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白表達(dá)呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，轉(zhuǎn)染72h達(dá)到高峰（P

18、均＜0.05）。Bcl-2在對(duì)照組呈高水平表達(dá)，轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx24h后，Bcl-2表達(dá)水平開(kāi)始下降，至轉(zhuǎn)染后72h降至最低（均P＜0.05）。Bax在對(duì)照組呈較低水平表達(dá)，轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx24h后，Bax表達(dá)水平開(kāi)始增加，至轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-HBx72h后，Bax表達(dá)水平最高（均P＜0.05）。AG490干預(yù)后，p-JAK2及p-STAT3的表達(dá)明顯下降;Bcl-2水平增加，Bax蛋白水平降低（均P＜