利用VIGS技術在番茄中驗證與萜類等代謝調控相關的柑橘同源基因.pdf

1、番茄果皮和果肉中能夠積累萜類和類黃酮物質，是初生和次生代謝相關基因功能研究的良好模式材料。目前，人們對能同時調控番茄類胡蘿卜素和類黃酮等代謝途徑的轉錄因子知之甚少。病毒誘導的基因沉默技術(VIGS)不需要遺傳轉化操作，可高效、快速地顯著降低擬沉默基因的表達量，是研究轉錄因子功能的重要技術手段。本研究以Micro-Tom番茄為材料，以TRV-PDS為陽性對照，利用VIGS、qRT-PCR及HPLC、GC-MS、LC-MS等分析檢測技術對7

2、個柑橘同源基因進行篩選，結果表明:
　　利用雙酶切技術，已成功構建TRV-DS陽性對照及7個柑橘同源基因的沉默載體;通過葉片滲透、果柄注射兩種方法侵染番茄植株，數天后，在新長出的葉片及果實中通過PCR擴增均能檢測到TRV1/TRV2病毒存在;TRV-PDS沉默植株新長出葉片出現明顯的光漂白現象，各沉默株系轉錄因子表達量的均顯著性下降，說明TRV有效復制、轉移，起到了良好的沉默效果。
　　沉默植株葉片類胡蘿卜素總量均顯著下降。

3、其中，TRV-ABA處理的沉默植株效果最為突出，紫黃質下降了2.90倍，達0.57±0.06mg/g(DW);葉黃素下降了2.25倍，達3.85±0.22mg/g(DW)，β-胡蘿卜素、玉米黃質、番茄紅素也分別下降了2.14、3.80、2.59倍;TRV-RAP和TRV-AGL沉默植株中玉米黃質和番茄紅素也均發(fā)生顯著性下降，有近6倍和3倍的差異。
　　沉默植株果實類胡蘿卜素總量均上升。其中，TRV-ACO沉默植株果實中β-胡蘿卜素

4、發(fā)生顯著性下降，達21.64±1.18μg/g(FW); TRV-RAP中番茄紅素和γ-胡蘿卜素與對照相比分別上升了1.90和2.53倍;TRV-ARG、TRV-DET、 TRV-ABA、TRV-GA沉默植株中γ-胡蘿卜素也顯著提高，與對照相比均提高了2倍以上。
　　利用LC-MS共檢測到葉片中氨基酸6種，酚酸及類黃酮物質26種，其中含量最高的是α-番茄堿，達到13.54±2.91μg/g(DW)。利用MPP軟件分析后發(fā)現沉默植株

5、葉片中類黃酮與對照相比組成和含量上沒有顯著變化。
　　果實中檢測到11種氨基酸，43種酚酸及類黃酮物質，比葉片中物質種類豐富。其中果實中含量最高的是香豆酸，達到22.26±1.77μg/g(DW)。利用MPP軟件分析后發(fā)現沉默植株果實中類黃酮與對照相比均有物質呈倍性增減，如山奈酚3-O蕓香糖苷、蘆丁、α-番茄堿、咖啡酰丁二胺等。
　　利用GC-MS技術共檢測到番茄果實揮發(fā)性物質38種，其中烯醛類占主要部分，含量最高的是經TR