結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-21對(duì)5-Fu代謝相關(guān)酶的調(diào)控及其靶基因的驗(yàn)證.pdf

1、目的:
　　臨床上腫瘤病人耐藥是一個(gè)相當(dāng)棘手的問(wèn)題，了解耐藥機(jī)制迫在眉睫。miR-21可能在結(jié)腸癌耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用，本研究即以探索結(jié)腸癌5-Fu耐藥機(jī)制的新線索為目的，可能為臨床個(gè)體化治療提供新的預(yù)測(cè)指標(biāo)。
　　方法:
　　本研究選用人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)攜帶不同基因片段的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞以調(diào)節(jié)miR-21的表達(dá)及作用，采用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證hMSH2為miR-21的潛在靶點(diǎn)。此外還采用TaqMan

2、探針?lè)╭RT-PCR及Western Blotting兩種技術(shù)方法分別從RNA水平及蛋白分子水平來(lái)檢測(cè)隨著miR-21的調(diào)節(jié)5-Fu代謝相關(guān)酶及hMSH2表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果:
　　1、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)hMSH2為miR-21的潛在靶基因。miR-21下調(diào)組熒光素酶活性明顯增強(qiáng)(p＜0.001)，而miR-21上調(diào)組的熒光素酶活性明顯減弱(p＜0.001)，結(jié)果表明miR-21能夠直接靶向結(jié)合于hMSH2的3'UTR

3、端。
　　2、TaqMan探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR從RNA水平進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-21對(duì)hMSH2的靶向作用，此外還表明miR-21與TP酶、DPD酶的表達(dá)存在負(fù)性調(diào)節(jié)作用(p＜0.05)。
　　3、在蛋白水平上通過(guò)Western Blotting發(fā)現(xiàn)miR-21對(duì)hMSH2以及TP酶、DPD酶表達(dá)的影響趨勢(shì)與RNA水平相一致，但對(duì)TS酶的表達(dá)無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論:
　　hMSH2是miR-21的潛在靶基因，同