番茄APX、AOBP、AO等Vc代謝相關(guān)基因的功能初步鑒定與分析.pdf

1、抗壞血酸即維生素C，是植物和大多數(shù)動物體內(nèi)合成的一類含量豐富的己糖內(nèi)酯化合物。它在生物體中具有重要的代謝功能和抗氧化作用，是保證人類健康所必需的營養(yǎng)物質(zhì)；同時還與植物細(xì)胞的分裂、伸長和植株生長有關(guān)。少數(shù)動物（包括人類）自身已經(jīng)喪失了合成能力，必須從食物中攝取，而植物是提供抗壞血酸的主要來源?？箟难峒捌浯x相關(guān)酶類在清除活性氧方面的作用使得抗壞血酸在植物抵抗環(huán)境脅迫中也起著重要作用。RNAi技術(shù)作為基因功能研究的一種非常有效手段得到了廣

2、泛的應(yīng)用。通過RNAi技術(shù)調(diào)控植物抗壞血酸生物代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)，改變某些代謝酶類的活性，獲得具有應(yīng)用潛力的高含量抗壞血酸的番茄材料，從而增加植物產(chǎn)品的營養(yǎng)價值，增強(qiáng)植物對逆境的抗性是可行的。 番茄是一種世界上廣為栽培的高營養(yǎng)、高價值的蔬菜作物，然而，目前番茄抗壞血酸生物代謝途徑中大部分基因的功能都不太明確，對其進(jìn)行轉(zhuǎn)基因調(diào)控的報道幾乎沒有。因此，本研究以番茄這一重要的蔬菜作物為材料，鑒定抗壞血酸生物代謝相關(guān)酶基因，即抗壞血酸

3、氧化酶啟動子結(jié)合蛋白、抗壞血酸氧化酶和2個抗壞血酸過氧化酶基因，將其構(gòu)建到植物RNAi研究載體pHGRV中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因植株，分析轉(zhuǎn)基因番茄的植株生長、生理生化及抗氧化逆境等特性，以期獲得具有應(yīng)用價值的抗壞血酸含量增加的番茄材料。獲得的主要結(jié)果如下： 1.分別構(gòu)建了抗壞血酸氧化酶AO（Ascorbate oxidase，AY971876）和抗壞血酸過氧化物酶tAPX（Ascorbate peroxidase，AF4

4、13573）這兩個基因的RNAi植物研究載體；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將它們成功導(dǎo)入番茄品種ZS5＃中。 2．獲得卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化植株11棵，PCR檢測和Southern blot結(jié)果表明，外源基因已整合到番茄基因組中，其拷貝數(shù)1—5個不等。 3．測定了抗壞血酸氧化酶AO（Ascorbate oxidase，AY971876）和抗壞血酸過氧化物酶tAPX（Ascorbate peroxidase，AF413573）T

5、1代RNAi植株抗壞血酸含量以及抗壞血酸氧化酶、抗壞血酸過氧化酶的活性，發(fā)現(xiàn)T1代轉(zhuǎn)基因植株果實抗壞血酸含量大部分得到提高，最高分別增加了0．59倍、1．16倍；相應(yīng)的抗壞血酸氧化酶，抗壞血酸過氧化酶的活性大部分降低，最低分別減少了53．59％、55．23％。且各轉(zhuǎn)基因株系間存在一定差異。 4．測定了抗壞血酸氧化酶啟動子結(jié)合蛋白AOBP（Ascorbate oxidase promoter—binding protein，TC1

6、55602）和抗壞血酸過氧化物酶cAPX（Ascorbate peroxidase，TC154675） T2代RNAi植株抗壞血酸含量以及抗壞血酸氧化酶、抗壞血酸過氧化酶的活性，發(fā)現(xiàn)T2代轉(zhuǎn)基因植株果實抗壞血酸含量大部分得到提高，最高分別增加了2．21倍、1．4倍；相應(yīng)的抗壞血酸氧化酶，抗壞血酸過氧化酶的活性大部分有所降低，最低分別減少了74．39％、92．55％。且各株系間存在一定差異。 5．利用RT—PCR技術(shù)測定不同單株葉

7、片表達(dá)量，結(jié)果各基因的表達(dá)量與酶活一致；利用番茄表達(dá)數(shù)據(jù)庫（Tomato Expression Database，TED）分析了番茄抗壞血酸生物代謝相關(guān)基因的數(shù)字表達(dá)譜，初步證明有3個基因在果實中高效表達(dá)。而tAPX基因沒有在果實中發(fā)現(xiàn)表達(dá)。 6．對4個轉(zhuǎn)基因植株后代的抗氧化逆境特性進(jìn)行了初步觀察，結(jié)果表明AOBP基因和2個APX基因的RNAi的轉(zhuǎn)基因植株后代的抗旱性、耐鹽性和對除草劑（百草枯）的抗性有一定程度的降低，但AO基因