番茄萜類化合物生物合成途徑相關(guān)酶基因的克隆與分析.pdf

1、植物通過類異戊二烯生物合成途徑產(chǎn)生的萜類化合物(terpenoid)，對(duì)植物的正常生長發(fā)育以及植物與生態(tài)環(huán)境之間的聯(lián)系起著重要的作用。萜類化合物具有重要的商業(yè)價(jià)值以及生態(tài)意義，萜類代謝工程成為目前次生代謝工程的研究熱點(diǎn)，尤其隨著萜類代謝途徑以及調(diào)控機(jī)理的深入研究，以基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)的代謝工程成為提高目標(biāo)萜類產(chǎn)物的最有潛力的手段之一。然而，萜類代謝途徑關(guān)鍵酶基因的克隆與鑒定工作是利用相關(guān)酶進(jìn)行基因操作進(jìn)而提高植物目標(biāo)萜類化合物產(chǎn)量的基礎(chǔ)

2、。
　　 番茄(Solanum lycopersicum)為世界性重要蔬菜作物，進(jìn)行番茄萜類代謝工程研究具有重要意義，可以通過萜類代謝工程對(duì)番茄的品質(zhì)、風(fēng)味、抗病、抗蟲等性狀進(jìn)行遺傳改良。目前，番茄萜類代謝工程已取得一定的研究進(jìn)展，番茄萜類生物合成途徑的一些相關(guān)酶基因已被克隆并進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因研究，但還有部分關(guān)鍵基因還未被克隆。因此，本研究以番茄為材料，克隆分析了3個(gè)萜類化合物生物合成相關(guān)酶基因，豐富并進(jìn)一步完善了番茄萜類化合物生物

3、合成途徑相關(guān)酶研究，為利用番茄萜類化合物生物合成途徑相關(guān)酶進(jìn)行萜類代謝工程研究奠定基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)果如下：
　　 1.以在GenBank搜尋到的煙草(Nicotiana tabacum)異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶2(IPI2)基因(AB049816)的cDNA為信息探針，在TIGR番茄數(shù)據(jù)庫里BLAST到一條電子拼接序列TC183769，根據(jù)該TC克隆出番茄異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶基因(SlIPI)的cDNA序列，其GenBank登錄號(hào)

4、為EU253957，測(cè)序結(jié)果表明，該cDNA全長708bp，編碼235個(gè)氨基酸，與TC183769的核酸同源性為99％，氨基酸同源性為100％。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示番茄IPI與其他植物IPI的同源性非常高。經(jīng)預(yù)測(cè)分析該SlIPI不含有葉綠體信號(hào)肽，定位于細(xì)胞質(zhì)與過氧化物體；SlIPI含有IPI蛋白質(zhì)的重要的功能區(qū)域—NUDIX domain及活性位點(diǎn)Cys88和Glu149。三維結(jié)構(gòu)模型分析表明，SlIPI與人類(Homo sapin

5、es)IPI結(jié)構(gòu)非常相似。通過半定量RT-PCR進(jìn)行IPI組織表達(dá)分析表明SlIPI在植物不同組織中表達(dá)水平有差異，在根中表達(dá)量最高。原核表達(dá)的重組SlIPI蛋白的分子量大小與通過軟件預(yù)測(cè)的分子量大小相同，為27.1KD。在大腸桿菌中超量表達(dá)SlIPI，可以推動(dòng)萜類生物合成代謝流，促進(jìn)β-胡蘿卜素的生物合成，從而驗(yàn)證了SlIPI的功能。
　　 2.以在GenBank搜尋到的擬南芥(Arabidopsis thaliana)3-羥

6、基-3-甲基戊二酰CoA合成酶(HMGS)基因(NM_117251)的全長cDNA為信息探針，在TIGR番茄數(shù)據(jù)庫里BLAST到一條電子拼接序列TC176556，根據(jù)該TC克隆出番茄3-羥基-3-甲基戊二酰CoA合成酶基因(SlHMGS)的cDNA序列，其GenBank登錄號(hào)為EU253956，測(cè)序結(jié)果表明，該cDNA全長1389bp，編碼462個(gè)氨基酸，與TC176556的核酸同源性為99％，氨基酸同源性為99％。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯

7、示番茄HMGS與其他植物HMGS的同源性較高。SlHMGS系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，SlHMGS與其他物HMGS具有共同的祖先。MotifScan分析表明SlHMGS含有3-羥基-3-甲基戊二酰CoA合成酶的活性位點(diǎn)。三維結(jié)構(gòu)模型分析表明，SlHMGS與芥菜(Brassica iuncea)HMGS結(jié)構(gòu)相似。原核表達(dá)的重組SlHMGS蛋白的分子量大小與通過軟件預(yù)測(cè)的分子量大小相同，為51.08KD。
　　 3.以在GenBank搜尋到

8、的橡膠樹(Hevea brasiliensis)甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧酶(MDC)基因(AF429368)的全長cDNA為信息探針，在TIGR番茄數(shù)據(jù)庫里BLAST到一條電子拼接序列TC172759，根據(jù)該TC序列克隆出番茄甲瓦龍酸-5-焦磷酸脫羧酶(SlMDC)基因的cDNA序列，其GenBank登錄號(hào)為EU216564，測(cè)序結(jié)果表明該cDNA全長1269bp，編碼422個(gè)氨基酸，與TC172759的核酸同源性為99％，氨基酸同源性