糖尿病大鼠缺血-再灌注后心肌微血管的損傷作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會提供的數(shù)據(jù)，目前全球糖尿病患者超過2.5億，預(yù)計到2025年這個數(shù)字將變成3.8億。由于人口基數(shù)大，中國將成為僅次于印度的糖尿病第二大國。因其起病隱匿且造成人體各個器官的血管損害，糖尿病絕對稱得上是人體的定時炸彈。目前糖尿病患者死亡的第一位原因就是冠心病。糖尿病合并冠心病患者多為多支血管病變且病變彌漫，PCI術(shù)后的無復(fù)流發(fā)生率和嚴(yán)重程度均明顯升高。糖尿病合并冠心病患者無復(fù)流現(xiàn)象的預(yù)防和治療已經(jīng)成為

2、心血管界介入治療和藥物治療面臨的新挑戰(zhàn)。
　　心臟血運重建的過程中出現(xiàn)無復(fù)流現(xiàn)象，無復(fù)流現(xiàn)象的可能機(jī)制為：
　?、傥⒀苁鎻埞δ苷系K及中性粒細(xì)胞栓塞；②血小板及中心粒細(xì)胞形成微血栓堵塞微血管；③細(xì)胞腫脹擠壓微血管；④血液粘滯性變化等。可見無復(fù)流現(xiàn)象與心肌微血管內(nèi)皮密切相關(guān)，但其發(fā)生的具體機(jī)制目前尚不清楚。糖尿病以引起多器官的微血管、小血管的病變而著稱，糖尿病患者無復(fù)流現(xiàn)象的發(fā)生很可能與心肌微血管的損傷密切相關(guān)。
　　多

3、項研究證實，糖尿病患者胰島素受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受損，引起eNOS表達(dá)減少，內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO的量及活性降低，可能與內(nèi)皮依賴性舒張功能障礙、血小板聚集等導(dǎo)致無復(fù)流發(fā)生的因素有關(guān)。而胰島素參與調(diào)節(jié)另一途徑即分裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑則保持完好，甚至加強(qiáng)，產(chǎn)生促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡效應(yīng)，這就是近年來有些學(xué)者提出的“選擇性”胰島素抵抗。I/R也是引起MAPK信號通路激活的常見刺激因素。在I/R的刺激下，糖尿病患者的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞會發(fā)生怎樣

4、的變化，以及這一變化產(chǎn)生的可能機(jī)制目前尚不清楚。
　　因此，本研究的實驗?zāi)康模?br>　　1．明確糖尿病大鼠缺血/再灌注后心肌微血管的損害是否比正常大鼠嚴(yán)重。
　　2．如果是，糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注后PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及MAPK通路的影響。這兩條信號通路之間是否存在相互關(guān)系。
　　3．如果兩條信號通路間的相互關(guān)系存在，此種關(guān)系在糖尿病引起的心肌微血管損害中起到什么樣的作用。
　　4．阻斷兩通路間的相互關(guān)系是

5、否可以改善糖尿病引起的心肌微血管損害。
　　實驗方法：
　　1．糖尿病大鼠模型的制備：
　　高脂高糖飲食飼養(yǎng)雄性成年SD大鼠（體重200g左右）3月后，給予低劑量STZ腹腔注射（50mg/kg），檢測造模前后血糖值，發(fā)現(xiàn)造模后大鼠血糖顯著增高，達(dá)糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。大鼠血糖升高1周后用于實驗。
　　2．缺血/再灌注模型的制備：
　　成年SD雄性大鼠，腹腔注射戊巴比妥麻醉，呼吸機(jī)輔助呼吸，于3～4肋間開胸1.5c

6、m，迅速暴露心臟，冠狀動脈左室支下穿線活扣結(jié)扎，以標(biāo)Ⅱ?qū)?lián)心電圖改變?yōu)樽钄嘌髦笜?biāo)，連續(xù)缺血30min，松線再灌注開始，關(guān)胸，制備大鼠心肌I/R模型。I/R術(shù)中通過八道生理記錄儀持續(xù)記錄大鼠心電圖、動脈壓及左室內(nèi)壓等血流動力學(xué)指標(biāo)。再灌注3h后采用伊文藍(lán)－硫磺素S雙染法測定心肌微血管損傷范圍，伊文藍(lán)－三苯四唑氯鹽（TTC）雙染法確定心肌梗死范圍。CD31免疫熒光染色確定各組心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量。再灌注后24h，心臟B超測量各組大鼠心

7、功能。
　　3．建立心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMECs）H/R模型：
　　無菌分離成年SD大鼠左心室組織，去除心內(nèi)外膜及冠脈組織，取心尖部心肌組織剪為1mm3組織塊，經(jīng)胰蛋白酶、膠原酶消化，條件培養(yǎng)及細(xì)胞純化后獲得CMECs。分離培養(yǎng)得到的CMECs置于缺氧細(xì)胞培養(yǎng)箱(95％N2/5％CO2,37℃)1h后重新置于正常細(xì)胞培養(yǎng)箱3h，硝酸還原法測定各組細(xì)胞NO的分泌量，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，westernblot方法檢測Cas

8、pase-3、P-JNK，JNK，PI3K、MEKK1、IRS-1等蛋白的表達(dá)及磷酸化水平。
　　實驗結(jié)果：
　　1．糖尿病（DM）大鼠缺血/再灌注后微血管損傷范圍顯著大于N+I/R大鼠（1.08±0.07％vs3.03±0.11％，P<0.01）梗死范圍顯著大于非糖尿病大鼠（57.49±1.25％vs68.39±2.31％,P<0.05）。DM大鼠缺血/再灌注后-dp/dtmax低于非糖尿病大鼠（-3613±88.67vs

9、.-4065.09±99.31，P<0.05）。DM大鼠缺血/再灌注后左室射血分?jǐn)?shù)較N+I/R組顯著降低（32.5±10.0％vs51.6±9.3％，P<0.05），也顯著低于D組（32.5±10.0％vs57.3±8.5％，P<0.05）DM大鼠缺血/再灌注后3h心肌CD31陽性的細(xì)胞密度較N+I/R組顯著降低（1600±82/mmvs2653±41/mm，P<0.05），較D組也顯著降低（1600±82/mmvs2590±52/mm

10、，P<0.05）。提示糖尿病大鼠缺血/再灌注后心肌微血管損傷及心功能損傷較非糖尿病大鼠加重。
　　2．缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷顯著增加糖尿病及正常大鼠CMEC的凋亡率（2.23±0.07％vs.31±2.32％,P<0.01和2.33±0.16％vs.38.17±1.97％,P<0.01）。Caspase-3的表達(dá)也呈現(xiàn)出相同的趨勢，另外，H/R處理后糖尿病大鼠CMECs表達(dá)Caspase-3的量顯著高于非糖尿病大鼠（P<0.05

11、）。H/R處理后糖尿病及非糖尿病大鼠CMECs分泌NO的能力均顯著下降（86.67±2.18％vs.56.67±1.28％,P<0.01and100％vs.74.67±0.96％,P<0.01），H/R后糖尿病大鼠CMECs分泌NO的量顯著低于非糖尿病大鼠（74.67±0.96％vs.56.67±1.28％,P<0.01）。這些結(jié)果提示，H/R對糖尿病大鼠CMECs的分泌功能及凋亡影響更大。
　　3．DM大鼠CMECsIRS-1的

12、磷酸化水平顯著降低（105.33±3.50％vs.56.27±4.60％,P<0.05）。PI3K的表達(dá)在糖尿病大鼠CMECs中的表達(dá)也有明顯下降（110.00±3.31％vs.82.22±3.31％,P<0.01），在糖尿病（82.22±3.31％vs.35.67±1.78％,P<0.01）和非糖尿?。?10.00±3.31％vs.89.67±2.91％，P<0.05）大鼠中均可見到H/R引起的PI3K的表達(dá)下降。H/R的刺激正常大鼠

13、的CMECs，MEKK1表達(dá)量（101.33±5.18％vs.299±7.36％,P<0.05）JNK的磷酸化水平（97.36±0.76％vs.162.33±4.49％，P<0.05）均顯著升高，H/R的刺激糖尿病大鼠的CMECs時，JNK的磷酸化水平增加更加顯著（148.47±12.27％vs.399.67±7.77％，P<0.01）。因此PI3K和JNK很可能是聯(lián)系糖尿病和缺血/復(fù)氧兩個病理過程的重要中間分子。
　　4．H/R

14、處理前1h給于PI3K的抑制劑LY294002（10μM）可進(jìn)一步增加H/R導(dǎo)致的DM大鼠CMECs的凋亡（39.07±5.48％vs.47.55±3.46％,P<0.01）。LY294002也進(jìn)一步增加H/R引起的DM大鼠CMECsCaspase-3蛋白的表達(dá)（338.00±29.53％vs.450.00±15.51％,P<0.05），減少H/R導(dǎo)致的大鼠CMECs分泌NO的量的減少（56.67±3.34％vs.41.00±5.72％

15、,P<0.05）。LY294002進(jìn)一步上調(diào)了H/R引起的DM大鼠CMECsJNK磷酸化水平的增加（260.75±8.76％vs.373.5±10.74％，P<0.01）。此部分結(jié)果說明，PI3K的抑制劑可通過激活JNK進(jìn)一步惡化H/R導(dǎo)致的DM大鼠CMECs細(xì)胞凋亡和分泌功能下降。
　　5．H/R使DM大鼠CMECs分泌NO的量顯著減低（86.67±5.67％vs.56.67±3.34％，P<0.01），H/R處理前給于JNK的

16、抑制劑SP600125（10μM）可部分改善DM大鼠CMECsNO分泌的減少（56.67±3.34％vs.68.75±8.58％，P<0.05）。SP600125降低H/R引起的糖尿病大鼠CMECsCaspase-3蛋白的表達(dá)增加（338.00±29.53％vs.260.67±26.91％,P<0.05）。H/R刺激下調(diào)DM大鼠PI3K的表達(dá)（82.00±9.93％vs.35.00±5.35％，P<0.01），JNK的抑制劑可部分上調(diào)因

17、H/R導(dǎo)致的PI3K的表達(dá)下降（35.00±5.35％vs.62.00±4.54％，P<0.05）。此部分結(jié)果說明，JNK的抑制劑通過激活PI3K改善H/R導(dǎo)致的DM大鼠CMECs的分泌功能，減少凋亡。
　　結(jié)論：
　　1．糖尿病大鼠缺血/再灌注后較非糖尿病大鼠心肌微血管損傷范圍、梗死范圍增加，心肌收縮、舒張能力均顯著下降，心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量減少。
　　2．DM大鼠CMECs缺氧/復(fù)氧處理后凋亡增加，NO分泌量下降

18、，同時伴有JNK磷酸化水平增加及PI3K的表達(dá)減少。
　　3．H/R刺激通過下調(diào)PI3K的表達(dá)減少DM大鼠CMECs分泌NO的量，而JNK的抑制劑可通過上調(diào)PI3K的表達(dá)，改善DM大鼠CMECs分泌NO的能力。
　　4．H/R也激活JNK，引起DM大鼠CMECs的凋亡，PI3K的抑制劑促使JNK進(jìn)一步活化，增加H/R引起的DM大鼠CMECs的凋亡。
　　上述結(jié)果提示MAPK信號通路與PI3K信號通路的相互關(guān)系參與缺血/