靶向β2-microglobulin的單克隆抗體抗多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤作用及分子機(jī)理.pdf

1、腫瘤研究的最終目標(biāo)是選擇性殺死全部腫瘤細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞。隨著對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)的研究進(jìn)展，以及對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，分化，轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究取得的進(jìn)展，在腫瘤治療領(lǐng)域出現(xiàn)了靶向治療的單克隆抗體和小分子化合物。多發(fā)性骨髓瘤是預(yù)后較差的病理亞型，目前的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是聯(lián)合化療，多數(shù)患者可獲得近期緩解，但不能長(zhǎng)期生存，屬不可治愈性疾病。其中多發(fā)性骨髓瘤患者的中位生存時(shí)間只有3-4年。近年來(lái)，thalidomide和lenalidomide，bort

2、ezomib與化療聯(lián)合或單獨(dú)應(yīng)用，對(duì)初治晚期疾病或復(fù)發(fā)難治性多發(fā)性骨髓瘤患者有較好療效，即使采用這些積極治療方法，多發(fā)性骨髓瘤患者的完全緩解率只有20-40％，大部分患者將會(huì)出現(xiàn)疾病進(jìn)展或者復(fù)發(fā)。因此，亟需探索新的治療手段。
　　 以單克隆抗體為主的靶向治療是目前腫瘤基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)，一些單克隆抗體已在臨床得到廣泛應(yīng)用，其中最成功的藥物是利妥昔單抗，美羅華(Rituximab)。但是，單克隆抗體藥物在多發(fā)性骨髓瘤等多種B細(xì)胞淋巴瘤

3、的研究進(jìn)展仍較緩慢，目前尚無(wú)此類藥物獲得批準(zhǔn)用于多發(fā)性骨髓瘤的治療。靶向治療在MM研究中進(jìn)展緩慢，主要原因是缺乏理想的治療靶點(diǎn)。我們發(fā)現(xiàn)β2微球蛋白(β2-microglobulin，B2M)是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。B2M是一個(gè)分子量11.8KD的非糖基化蛋白鏈，包括100左右氨基酸分子，是MHC-I類分子的—跳單鏈。它的功能主要是與與另外一條a單鏈相互作用并穩(wěn)定MHC蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。由于B2M與a單鏈之間沒有分子鍵相互作用，也不與細(xì)胞表

4、面緊密連接，因此可以分泌到血清中。在淋巴瘤和白血病中，腫瘤的患者的血清B2M水平升高提示預(yù)后不良。這種升高與患者腎功能沒有相關(guān)性。在基礎(chǔ)研究中，B2M的表達(dá)與功能在多種腫瘤細(xì)胞系中得到證實(shí)。
　　 本研究假設(shè)B2M作為靶點(diǎn)并制備單克隆抗體，對(duì)骨髓瘤細(xì)胞在體內(nèi)外均有較高的凋亡誘導(dǎo)作用，采用一系列實(shí)驗(yàn)來(lái)證明我們的假設(shè)。我們發(fā)現(xiàn)首先檢測(cè)了B2M蛋白在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，淋巴瘤細(xì)胞，乳腺癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞表面的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞

5、表面表達(dá)最高，其次是淋巴瘤細(xì)胞，乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞表面B2M表達(dá)強(qiáng)度為骨髓瘤細(xì)胞的40-50％。我們發(fā)現(xiàn)靶向B2M的單克隆抗體，PA43，可以有效地誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，在淋巴瘤細(xì)胞也可以看到顯著的凋亡發(fā)生，而在乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞也有一定比例(50％)細(xì)胞發(fā)生凋亡。這種凋亡作用是與抗體的濃度和作用時(shí)間呈現(xiàn)依賴性關(guān)系。在這些細(xì)胞中，凋亡的比例與B2M表達(dá)強(qiáng)度無(wú)明顯比例關(guān)系。在沒有表達(dá)B2M的細(xì)胞中沒有觀察到凋亡細(xì)胞發(fā)生。

6、>　　 骨髓瘤細(xì)胞的生存依賴于正常骨髓基質(zhì)和細(xì)胞的支持。在Transwell實(shí)驗(yàn)中，與MM細(xì)胞共同培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞沒有受到PA43誘導(dǎo)的凋亡，提示PA43僅特異性殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞沒有毒性。
　　 研究發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞因子對(duì)骨髓瘤細(xì)胞有保護(hù)作用，這些因子是否可以拮抗PA43的作用是值得關(guān)注的問題之一。例如，研究發(fā)現(xiàn)白介素因子-6(interleukin-6，IL-6)和胰島素樣生長(zhǎng)因子1(Insulin-like grow

7、th factor-1，IGF-I)可以保護(hù)骨髓瘤細(xì)胞免受地塞米松誘導(dǎo)的凋亡，在本研究中，我們?cè)谂囵B(yǎng)基中加入IL-6或IGF-I因子，PA43仍然可以誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，提示IL-6和IGF-I不能保護(hù)PA43對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的殺傷作用。
　　 為了探索IgM抗體的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，我們使用裂解劑2-巰基乙醇(betamercaptoethanol，2ME)將PA43(IgM五聚體結(jié)構(gòu))裂解為單體，發(fā)現(xiàn)IgM單體不能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞

8、凋亡，提示其五聚體結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)。免疫共聚焦顯微鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)PA43作用后，骨髓瘤細(xì)胞膜上的lipid rafts聚集形成帽狀結(jié)構(gòu)，并募集主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex-I，MHC-I)分子進(jìn)入lipid rafts，而排除lipid rafts中的IL-6受體。通過與MHC-I分子結(jié)合，激活下游caspase-9，-3，和PARP蛋白，并降低抗凋亡的Bcl-2家族蛋白Bcl-2和B

9、cl-xL的表達(dá)水平，通過活化內(nèi)源性凋亡途徑和線粒體依賴性凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。與利妥昔單抗一樣，PA43單抗改變了腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的鈣離子內(nèi)流。
　　 在移植瘤小鼠模型中，PA43抗體顯著減小了腫瘤體積，降低了血清中M蛋白的濃度，顯著延長(zhǎng)了治療組小鼠的生存期。由于PA43的靶點(diǎn)是Beta-2 microglobulin(B2M)蛋白，而B2M蛋白是MHC-I分子的主要組成部分，雖然在正常組織雖然β2M/MHC class I的表達(dá)

10、密度比多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤細(xì)胞較低，但β2M/MHC-I在體內(nèi)的細(xì)胞和組織分布較為廣泛，因此，PA43是否對(duì)正常組織和細(xì)胞有凋亡誘導(dǎo)作用是值得關(guān)注的問題。通過在severe combined immunodeficiency(SCID)小鼠與來(lái)自多發(fā)性骨髓瘤患者的腫瘤細(xì)胞注射的人胎盤骨移植后構(gòu)建形成SCID-hu小鼠模型以及人多發(fā)性骨髓瘤動(dòng)物模型(HLAA2-transgenic NOD/SCID mice)動(dòng)物模型中，無(wú)論小鼠組織中是

11、否有表達(dá)成熟和有功能的人類MHC-I分子表達(dá)，PA43均對(duì)正常組織沒有凋亡作用。
　　 總結(jié)本研究結(jié)果，PA43通過細(xì)胞表面的B2M/MHC-I蛋白結(jié)合，活化下游caspase-9，-3，和PARP蛋白，并降低抗凋亡的Bcl-2家族蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)水平從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中，PA43對(duì)正常細(xì)胞和組織沒有毒性。我們的研究表明B2M是理想的治療靶點(diǎn)，為靶向B2M的單克隆抗體在臨床的進(jìn)一步研究提高實(shí)