Treg-Th17平衡在日本血吸蟲蟲卵免疫調(diào)節(jié)TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎中的作用研究.pdf

1、炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一種慢性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)和克隆病(Crohn’s disease，CD)。IBD在發(fā)達(dá)國家中非常常見，每10萬人中就有100-200個患者，遠(yuǎn)高于亞洲和非洲地區(qū)。我國IBD的發(fā)病率也在逐年遞增。但現(xiàn)有的藥物和外科手術(shù)治療 IBD的效果均不顯著，且?guī)碓S多的不良反應(yīng)。因此，尋找預(yù)防和治療IBD的新制劑并

2、闡明其作用機(jī)制成為目前IBD研究領(lǐng)域亟待解決的問題。
　　CD的發(fā)病機(jī)制目前仍不完全清楚，但免疫因素在其中起著重要作用。三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型因其與CD的臨床發(fā)病特點(diǎn)類似，并且建模過程操作簡單、重復(fù)性好，成為研究IBD的一種經(jīng)典動物模型。一系列研究表明，蠕蟲感染可減少免疫性疾病如糖尿病、多發(fā)性硬化和克隆病的發(fā)生。而其中生命周期長、組織內(nèi)寄

3、生的血吸蟲及其免疫活性產(chǎn)物在多種自身免疫性疾病中顯示出較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能和保護(hù)作用。有研究顯示，曼氏及日本血吸蟲蟲卵均可對TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎產(chǎn)生保護(hù)作用。但迄今為止，日本血吸蟲蟲卵對于TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎整個病程的免疫調(diào)節(jié)作用尚無報道。
　　雖然血吸蟲蟲卵可對TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎產(chǎn)生保護(hù)作用，但其發(fā)揮保護(hù)作用的具體機(jī)制仍有待深入闡明。新近研究表明，多種自身免疫性疾病患者體內(nèi)，包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）和多發(fā)性硬化（

4、MS）等，存在Treg/Th17免疫失衡；并且Treg/Th17免疫失衡在 IBD炎癥發(fā)生中起著重要的作用。有研究顯示，曼氏血吸蟲可溶性蟲卵抗原（SEA）可上調(diào)Ⅰ型糖尿病模型中Treg細(xì)胞的比例。另有研究報道，曼氏血吸蟲SEA在誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)Tre g效應(yīng)細(xì)胞因子TGF-β及IL-10表達(dá)，同時可抑制Th17細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞因子IL-17的分泌。以上研究提示，血吸蟲對結(jié)腸炎的保護(hù)作用，不僅與Treg有關(guān)，而且與Th17的作用有關(guān)，但寄

5、生蟲感染是否通過調(diào)控Treg/Th17的平衡來干預(yù)IBD的發(fā)生尚未見報道。
　　因此，本課題首先觀察了日本血吸蟲蟲卵對小鼠結(jié)腸炎整個病理進(jìn)程的免疫調(diào)節(jié)作用，接下來在證實(shí)TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎中存在Treg/Th17失衡的基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步探討Treg/Th17平衡在日本血吸蟲蟲卵免疫調(diào)節(jié)小鼠結(jié)腸炎中的作用，從而為闡明血吸蟲蟲卵對結(jié)腸炎保護(hù)作用的免疫學(xué)機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　本課題分為以下二個部分:
　　一、日本血吸蟲蟲

6、卵對TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的免疫調(diào)節(jié)作用
　　1.本實(shí)驗(yàn)采用 TNBS建立小鼠急性結(jié)腸炎模型，觀察和記錄小鼠的一般癥狀、體重、結(jié)腸組織局部炎癥以及生存率改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和正常對照組相比，TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠出現(xiàn)了豎毛、少動和粘液血便等一般腸炎癥狀。在造模后第1天小鼠體重下降了8％，第3天開始回升，但至造模后第7天依然明顯低于正常對照組。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在造模后的第3天和第5天小鼠結(jié)腸組織局部炎癥明顯，但在造模后第7天逐漸緩解。另

7、外，在造模后第3天小鼠生存率降到低峰，至造模后第5天已降到30%，并進(jìn)入平臺期。以上研究結(jié)果表明，TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型建立成功。
　　2.接下來，我們觀察日本血吸蟲蟲卵對 TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎不同時間點(diǎn)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與結(jié)腸炎對照組相比，在造模后的第3天，提前給予日本血吸蟲蟲卵免疫會加重結(jié)腸炎小鼠粘液血便等一般癥狀，但在造模后第5天和第7天可明顯減輕這些癥狀。另外，在造模后第1到3天其體重下降更快，但在造模后第5到7

8、天回升更快，并接近正常水平。結(jié)果提示，日本血吸蟲蟲卵在造模后第3天會加重結(jié)腸組小鼠的體重丟失，但在造模后第5天和第7天均可促進(jìn)結(jié)腸炎小鼠的體重快速恢復(fù)。此外，提前給予日本血吸蟲蟲卵免疫在造模后第3天加重結(jié)腸組織局部炎癥，但在造模后第5天和第7天均可減少小鼠結(jié)腸組織局部炎癥反應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)中血吸蟲蟲卵對小鼠結(jié)腸組織局部炎癥反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用，與其對結(jié)腸炎組小鼠體重變化的影響時間趨勢基本一致。蟲卵免疫結(jié)腸炎組在造模后的第5天和第7天的生存

9、率均達(dá)到90%，顯著高于結(jié)腸炎組。上述結(jié)果說明，日本血吸蟲蟲卵在TNBS造模后的第5天和第7天可通過減輕小鼠結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)改善結(jié)腸炎小鼠的一般癥狀和體重，提高結(jié)腸炎小鼠生存率。在TNBS造模后的第3天盡管會加重結(jié)腸炎小鼠的一般癥狀和局部炎癥反應(yīng)，但對結(jié)腸炎的小鼠生存率沒有影響。
　　二、Treg/Th17平衡在日本血吸蟲蟲卵免疫調(diào)節(jié)TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎中的作用1.本實(shí)驗(yàn)首先采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了各組小鼠脾臟中Treg和Th17

10、細(xì)胞比例的動態(tài)變化，并計(jì)算不同時間點(diǎn)Treg/Th17比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠脾臟中Treg細(xì)胞比例雖然在造模后的第3天輕度增高，但在造模后第5和第7天其比例均降低。脾臟中Th17細(xì)胞比例在造模后的第3天明顯升高，之后開始下降，至造模后第7天降至正常水平。脾臟中Treg/Th17細(xì)胞比例在造模后第3天明顯低于正常對照組，并隨病程延長持續(xù)降低，提示TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠脾臟中存在Treg/Th17失衡。此外，結(jié)腸炎小鼠脾

11、臟中Treg/Th17細(xì)胞的比例變化趨勢同小鼠結(jié)腸組織炎癥的嚴(yán)重程度呈明顯負(fù)相關(guān)（R2=-0.88）。
　　2.在證實(shí)了TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎中存在Treg/Th17免疫失衡的基礎(chǔ)之上，本課題接下來研究日本血吸蟲蟲卵是否是通過調(diào)控Treg/Th17的免疫平衡從而達(dá)到對小鼠結(jié)腸炎的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，與結(jié)腸炎對照組相比，預(yù)先給予日本血吸蟲蟲卵在造模后第3天可下調(diào)結(jié)腸炎小鼠脾臟中Tre g細(xì)胞比例，同時上調(diào)脾臟中Th17細(xì)胞比例

12、；在造模后第5天，則明顯下調(diào)脾臟中Th17細(xì)胞比例；至造模后第7天蟲卵免疫的結(jié)腸炎小鼠脾臟中Treg細(xì)胞比例明顯升高而Th17細(xì)胞顯著下降。因此，單用Treg或Th17都不足以解釋血吸蟲蟲卵對小鼠結(jié)腸炎的免疫調(diào)控作用。計(jì)算Treg/Th17細(xì)胞比例，結(jié)果顯示，Treg/Th17的比例在造模后的第3天明顯下調(diào)，但在造模后第7天顯著升高。另外，我們采用Western Blot及免疫組織化學(xué)法檢測了蟲卵對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中Treg細(xì)胞特異性

13、核轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和Th17細(xì)胞特異性核轉(zhuǎn)錄因子RORγt蛋白水平表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲蟲卵在造模后第3和第5天會抑制結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中Foxp3蛋白的表達(dá)，但之后可促進(jìn)其表達(dá)量的升高；RORγt蛋白的表達(dá)在造模后第3天增高，而在造模后第5和第7天其蛋白表達(dá)顯著降低。以上結(jié)果說明，血吸蟲蟲卵不僅對Tre g和Th17細(xì)胞的比例產(chǎn)生影響，還可調(diào)節(jié)Treg和Th17細(xì)胞的活化狀態(tài)。ELISA檢測小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清和外周血中Tr

14、eg細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞因子（TGF-β和IL-10）和Th17細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞因子IL-17A的水平。結(jié)果顯示，蟲卵在造模后第5和第7天明顯的促進(jìn)了脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β的表達(dá)。雖然在造模后第3天上調(diào)結(jié)腸炎小鼠脾臟和外周血中IL-17A的含量，而從造模后第5天開始，則明顯抑制了外周血和脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A的水平。因此，血吸蟲蟲卵對結(jié)腸炎的免疫調(diào)節(jié)作用與其逆轉(zhuǎn)結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)的Treg/Th17免疫失衡效應(yīng)密切相關(guān)。
　　綜上所

15、述，本課題的研究結(jié)果為：
　　1．闡明了日本血吸蟲蟲卵對TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎整個病程的免疫調(diào)節(jié)作用，表現(xiàn)為：日本血吸蟲蟲卵在TNBS造模后的第5天和第7天可通過減輕小鼠結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)，改善結(jié)腸炎小鼠的一般癥狀和腸道炎癥，促進(jìn)體重恢復(fù)，從而提高結(jié)腸炎小鼠生存率。但在TNBS造模后的第3天，預(yù)先給予血吸蟲蟲卵盡管會加重結(jié)腸炎小鼠的一般癥狀和局部炎癥反應(yīng)，但對結(jié)腸炎小鼠生存率沒有影響。
　　2.本實(shí)驗(yàn)初步闡明TNBS誘導(dǎo)的實(shí)