Notch1通路介導(dǎo)姜黃素拮抗血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制研究.pdf

1、背景:內(nèi)皮細(xì)胞在調(diào)節(jié)血管功能、生理和病理生理過程中起著至關(guān)重要的作用,內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial cell,EC)氧化應(yīng)激損傷(oxidative stress injury,OSI)是動脈粥樣硬化、高血壓和糖尿病等心血管疾病的重要組成部分,預(yù)防和治療內(nèi)皮OSI具有很重要的臨床意義。但是由于OSI有多種細(xì)胞因子和信號通路參與其中,因此迄今OSI的病理生理機(jī)制尚未明了。過氧化氫(H2O2)處理細(xì)胞可以在短時間內(nèi)模擬細(xì)胞OSI。

2、>　　Notch1信號通路是一種生物進(jìn)化過程中高度保守的信號通路,且在調(diào)控生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用。Notch1通路調(diào)控細(xì)胞間的聯(lián)系、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞核內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄,此外,Notch1通路還影響細(xì)胞活動,包括細(xì)胞增殖、遷移、生長、分化和死亡。最新研究表明,上調(diào)Notch1信號通路可加重OSI,提示抑制Notch1信號通路可能會是一種保護(hù)細(xì)胞免受OSI的有效方法。
　　姜黃素(Curcumin,Cur)是一種常見的

3、傳統(tǒng)中藥,是從姜科天南星植物的根莖中提取的一種天然物質(zhì),具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。姜黃素在心血管領(lǐng)域具有心肌保護(hù)、抗炎、抗氧化、抗癌等多重心血管保護(hù)作用。然而,Cur抗H2O2誘導(dǎo)的OSI是否通過調(diào)控Notch1信號通路實(shí)現(xiàn)尚需進(jìn)一步研究。
　　目的:在此項(xiàng)研究中,我們通過建立細(xì)胞OSI模型初步探索Notch1信號通路在過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cel

4、ls,HUVECs)氧化應(yīng)激損傷過程中所扮演的角色,以及 Cur在此過程中是否具有保護(hù)作用,且是否通過調(diào)控Notch1信號通路發(fā)揮作用。
　　方法:實(shí)驗(yàn)一,DAPT(γ-分泌酶抑制劑),是Notch1信號通路的特異性阻斷劑,我們用DAPT和Notch1 siRNA干擾來研究Notch1信號通路在氧化應(yīng)激損傷中所起的作用。我們把體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分為六組,空白組、H2O2組、H2O2+DAPT組、H2O2+Notch1siR

5、NA組、DAPT組和Notch1siRNA組。選取不同濃度梯度的H2O2(100、200、400μmol/l)的培養(yǎng)液下培養(yǎng),損傷時間控制為4小時,建立氧化應(yīng)激損傷模型。各組細(xì)胞經(jīng)處理后,MTT檢測細(xì)胞存活率,TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡率,檢測細(xì)胞粘附力和遷移力,專用試劑盒檢測各組細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放量和氧自由基(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)的含量,免疫熒光和West

6、-blot檢測各組細(xì)胞各蛋白Notch1、Hes1、Bcl-2、Caspase3、Bax、細(xì)胞色素C(cytochrome C)的表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)二,通過實(shí)驗(yàn)一我們把400μmol/l濃度H2O2損傷4小時這個損傷條件作為實(shí)驗(yàn)二的損傷條件。細(xì)胞分為四組,空白組、H2O2組、Cur+H2O2組和Cur組,細(xì)胞處理方法同上,各組細(xì)胞經(jīng)處理后,MTT檢測細(xì)胞存活率,TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡率,檢測細(xì)胞粘附力和遷移力,專用試劑盒檢

7、測各組細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放量和氧自由基(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)的含量,免疫熒光和West-blot檢測各組細(xì)胞各蛋白Notch1、Hes1、Bcl-2、Caspase3、Bax、細(xì)胞色素C(cytochrome C)的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一,MTT分析和TUNEL染色研究結(jié)果顯示,與空白對照組相比,H2O2組細(xì)胞存活率和粘附能力顯著降低,凋亡率顯著升高

8、,且呈濃度和時間依賴效應(yīng)(P<0.01)。酶學(xué)測定顯示,與空白對照組相比,H2O2組細(xì)胞LDH釋放量和ROS含量顯著升高,SOD、GSH-Px和MDA含量顯著降低(P<0.01)。West-blot結(jié)果顯示,與空白對照組相比,H2O2可顯著上調(diào)Notch1和Hes1的表達(dá),且濃度越高,Notch1和Hes1上調(diào)越明顯(P<0.01)。我們還發(fā)現(xiàn),400μmol/l濃度H2O2損傷4小時損傷適中,于是我們把其作為下一步的研究的損傷條件。與

9、H2O2組相比,DAPT+ H2O2組和H2O2+Notch1 siRNA組細(xì)胞存活率和粘附能力顯著升高,凋亡率顯著下降,細(xì)胞LDH釋放量和ROS含量顯著降低,SOD、GSH-Px和MDA含量顯著升高(P<0.01)。West-blot結(jié)果顯示,與H2O2組相比,DAPT和Notch1 siRNA可顯著下調(diào)Nothc1、Hes1、Caspase3和Bax的表達(dá),上調(diào)Bac-2的表達(dá)(P<0.01)。與空白對照組相比,單獨(dú)DAPT組和No

10、tch1 siRNA組細(xì)胞無明顯變化,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明,抑制Notch1信號通路可以拮抗人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,提示 Notch1信號通路在HUVECs氧化應(yīng)激損傷中扮演重要角色。
　　實(shí)驗(yàn)二,與空白對照組相比,H2O2組細(xì)胞存活率和粘附能力顯著降低,凋亡率顯著升高(P<0.01)。酶學(xué)測定顯示,與空白對照組相比,H2O2組細(xì)胞LDH釋放量和ROS含量顯著升高,SOD、GSH-Px和MDA含量顯著降低(P<0.01)。

11、West-blot結(jié)果顯示,與空白對照組相比,H2O2可顯著上調(diào)Notch1和Hes1的表達(dá)(P<0.01)。與H2O2組相比,Cur+ H2O2組細(xì)胞存活率和粘附能力顯著升高,凋亡率顯著下降,細(xì)胞LDH釋放量和ROS含量顯著降低,SOD、GSH-Px和MDA含量顯著升高,且在25μM濃度Cur處理?xiàng)l件下效果最明顯(P<0.01)。West-blot結(jié)果顯示,與H2O2組相比,Cur可顯著下調(diào)Nothc1、Hes1、Caspase3和B