Treg在CVB3誘導的心肌纖維化中的作用及機制研究.pdf

1、B3型柯薩奇病毒(CVB3)是一種典型的腸道病毒，感染人體導致機體一系列急性或慢性疾病，如心肌炎、腦膜炎、胰腺炎等。病毒性心肌炎的慢性化過程伴隨著心肌纖維化，常與炎癥并存于病變心肌部位。研究已證實在CVB3誘導的心肌炎小鼠模型中炎癥細胞與心室的纖維化相關，其通過分泌細胞因子、趨化因子或生長因子等形成炎癥微環(huán)境使成纖維細胞異常分泌ECM。心肌纖維化可導致心肌壁增厚、心臟擴張、心肌功能逐步喪失，已成為影響人類健康的重大衛(wèi)生問題，但是迄今還沒

2、有有效防治心肌纖維化的措施。
　　心肌纖維化是指心臟組織中異常活化的心肌成纖維細胞，過量分泌細胞外基質（extracellular matrix，ECM），導致基質蛋白在心肌層大量積累的一種在多種心血管疾病中普遍存在的病理變化，與心律失常、心功能障礙甚至心肌性猝死密切相關。已有研究發(fā)現T淋巴細胞能夠調節(jié)纖維化的發(fā)生，并提出炎癥細胞與心室纖維化相關。近期研究發(fā)現不同T細胞亞群在小鼠心室重構中發(fā)揮不同作用。炎癥條件下，Th1應答具抗纖

3、維化作用，然而Th2卻會促進纖維化。調節(jié)性T細胞(Treg)是一群具有免疫抑制作用的CD4+T細胞亞群，其在維持免疫耐受以及調節(jié)抗病毒免疫應答中扮演了重要的角色。但是Treg在CVB3誘導的心肌纖維化中作用及作用機制仍不是很清楚。
　　為了闡明Treg在小鼠病毒性心肌炎纖維化過程中的作用及其可能免疫機制，在本研究中，我們利用CVB3感染雄性BALB/c小鼠誘導心肌纖維化模型，觀察了CVB3感染過程中心肌炎纖維化發(fā)生的過程，并檢測了

4、其中Treg的動態(tài)改變。隨后，通過體內清除和體內輸注Treg，進一步闡明了Treg對于病毒性心肌炎纖維化發(fā)生的作用;最后，通過體內外試驗，初步闡述了Treg參與病毒性心肌炎纖維化的作用的分子免疫學機制。
　　第一部分 CVB3感染誘導心肌纖維化小鼠模型的建立
　　以10 TCID50 CVB3感染BALB/c雄性小鼠，用real time-PCR檢測了與膠原蛋白合成相關的Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ)，與膠原蛋白降解相

5、關的基質金屬蛋白酶(MMP-1、MMP-3)和基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1 (TIMP-1)mRNA的表達變化;以天狼猩紅染色檢測心肌層膠原纖維的沉積情況。實驗結果表明，隨CVB3感染時間的延長，小鼠心臟局部collagen Ⅰ mRNA水平顯著增高;MMP-1和MMP-3 mRNA的表達量顯著下調，相對于對照組，TIMP-1 mRNA的表達量在1到4周均上調，TIMP-1/MMP-1和TIMP-1/MMP-3的比值均明顯增高。同時病理

6、顯示:感染小鼠的心肌層積累了大量的膠原纖維。以上數據表明，我們用10 TCID50 CVB3感染雄性BALB/c小鼠，成功建立了病毒性心肌纖維化模型。
　　第二部分 Treg在CVB3誘導心肌纖維化發(fā)生中的作用
　　一、Treg與CVB3誘導的心肌纖維化呈負相關
　　為了研究Treg是否在心肌纖維化過程中發(fā)揮作用，我們首先以流式細胞術檢測了CVB3感染后小鼠體內Treg的變化。結果表明，CVB3感染后第1周外周血和心臟

7、組織中分別含有0.22％和1％ Treg，之后其比例逐步下降。提示在心肌纖維化越來越嚴重的階段（2-4周），Treg的比例逐步減少。為明確Treg與心肌纖維化的相關性，在CVB3感染小鼠4周時，檢測了每一只小鼠外周血中Treg的比例以及膠原蛋白mRNA的表達水平和小鼠心臟中膠原纖維的沉積程度。結果表明，小鼠外周血Treg越少，其膠原蛋白mRNA表達量越多，而且心臟中膠原沉積的程度越嚴重。以上數據證明Treg與心肌纖維化呈負相關，并初步提

8、示調節(jié)性T細胞具有抑制纖維化的作用。
　　二、去除Treg可加劇CVB3誘導的心肌纖維化
　　為了進一步證明Treg具有抑制纖維化作用，以anti-CD25單克隆抗體腹腔注射小鼠去除CVB3感染小鼠中的Treg，觀察心肌纖維化的情況。發(fā)現，相對于對照組（Isotype+CVB3組），anti-CD25注射組小鼠心臟局部collagen Ⅰ表達顯著上調，TIMP-1、TIMP-1/MMP-1以及TIMP-1/MMP-3表達上調

9、，提示膠原蛋白合成增加而降解減少。天狼猩紅染色與上述結果一致，在體內去除Treg的小鼠心肌層中，沉積了更多的膠原纖維。以上實驗提示，在CVB3誘導的心肌纖維化模型中，去除Treg可加劇心肌纖維化程度。
　　三、輸注Treg可緩解CVB3誘導的心肌纖維化
　　以上結果提示小鼠Treg不足時，CVB3感染后會導致更為嚴重的心肌纖維化。我們推測增加小鼠體內的Treg的數量，可緩解CVB3誘導的心肌纖維化。 為驗證這一推論，從感染的

10、小鼠脾臟中分離得到Treg并將其回輸至小鼠體內，并用CVB3感染小鼠。發(fā)現:較只感染了CVB3的小鼠，輸注Treg的小鼠心肌層中膠原沉積大幅減少，心臟局部collagen Ⅰ、TIMP-1、TIMP-1/MMP-1和TMP-1/MMP-3的變化同樣有利于心肌纖維化得到改善。實驗結果提示，體內增加Treg數量有利于緩解CVB3誘導的心肌纖維化。
　　綜合以上實驗結果提示，Treg能夠顯著抑制CVB3誘導的心肌纖維化，干預小鼠體內的T

11、reg數量，可顯著改變心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。
　　第三部分 Treg抑制CVB3誘導心肌纖維化的分子機制
　　一、Treg抑制心肌纖維化作用的細胞非接觸途徑可能通過TGFβ和IL-10介導
　　已知Treg通過細胞接觸和細胞非接觸機制（分泌抑制性細胞因子）發(fā)揮抑制功能，為研究Treg抑制CVB3誘導的心肌纖維化的作用機制，我們在回輸Treg的同時分別給予小鼠抗TGFβ或抗IL-10的中和抗體。發(fā)現，相較于輸注Treg小

12、鼠，TGFβ抗體組和IL-10抗體組的小鼠心肌層均發(fā)現更多的膠原纖維沉積。以上結果初步提示，TGFβ和IL-10在Treg介導的減弱心肌纖維化的過程中均發(fā)揮重要作用。
　　為了進一步證實TGFβ和IL-10在抑制CVB3誘導的心肌纖維化中的作用，我們用anti-CD25去除小鼠體內Treg，同時分別注射細胞因子TGFβ或IL-10。結果顯示，去除了Treg的小鼠心肌纖維化顯著加重，而在此基礎上補充細胞因子TGFβ和IL-10可一定

13、程度上減輕心肌纖維化，但仍然要比未去除Treg組的感染小鼠的心肌纖維化嚴重。以上數據表明，Treg改善CVB3誘導的心肌纖維化部分依賴于細胞因子TGFβ和IL-10，同時也提示，Treg可能還通過其他途徑如細胞接觸機制抑制心肌纖維化的發(fā)生。
　　二、Treg抑制心肌纖維化作用存在細胞接觸和非接觸途徑
　　體內試驗已經發(fā)現Treg可通過分泌細胞因子發(fā)揮抑制心肌纖維化的作用，我們通過體外試驗進一步驗證Treg抑制成纖維細胞的作用

14、機制。從感染了CVB3的小鼠心臟中分離得到心肌成纖維細胞(cardiac fibroblast，CF)和Treg，二者以不同比例(CF∶ Treg;1∶1，1∶2.5，1∶5)共培養(yǎng)，檢測其Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ)、基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）、基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)和基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）mRNA的表達水平，發(fā)現Treg能夠減少成纖維細胞Ⅰ型膠原蛋白collagen Ⅰ的合成，同時降低TI

15、MP-1的表達，并且呈劑量依賴。為 闡明體外Treg抑制心肌成纖維細胞的分子機制，采用transwell培養(yǎng)體系共培養(yǎng)成纖維細胞和Treg，發(fā)現:相較于接觸培養(yǎng)體系中成纖維細胞collagen Ⅰ的表達量，非接觸培養(yǎng)體系中成纖維細胞的collagen Ⅰ的表達量增多，說明Treg能夠通過分細胞接觸抑制的途徑抑制成纖維細胞;相對于對照組(不加Treg)，非接觸Treg共培養(yǎng)的成纖維細胞的collagen Ⅰ下調表達，說明Treg能夠通過分

16、泌細胞因子抑制成纖維細胞。提示:Treg與成纖維細胞之間的相互作用部分依賴細胞接觸，部分依賴分泌細胞因子。接下來，向非接觸的共培養(yǎng)體系中分別添加不同濃度的抗TGFβ和抗IL-10的抗體，發(fā)現IL-10抗體能夠有效地降低Treg對心肌成纖維細胞的抑制功能。體外實驗提示，Treg主要通過細胞接觸和分泌細胞因子(IL-10)的途徑發(fā)揮對心肌成纖維細胞的抑制作用。
　　綜上所述，我們闡明了調節(jié)性T細胞可通過細胞接觸依賴和細胞非接觸依賴的途

17、徑抑制CVB3誘導的心肌纖維化。在CVB3誘導的病毒性心肌纖維化過程中，Treg比例與心肌纖維化程度呈負相關。體內清除Treg可加劇心肌纖維化，而輸注Treg則可緩解心肌纖維化程度，提示Treg具有顯著抑制心肌纖維化的作用。進一步體內外中和試驗提示:Treg抑制心肌纖維化的作用部分依賴于Treg分泌的細胞因子，部分依賴于Treg膜表面的抑制性分子，具體機制還需深入研究。本研究以Treg為切入點，深入研究其在CVB3病毒性心肌炎纖維化中的