JNK信號(hào)通路介導(dǎo)Bex2對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的作用研究.pdf

1、目的：1．檢測(cè)人腦膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本中Bex2的表達(dá)水平，分析其與膠質(zhì)瘤發(fā)生的相關(guān)性；2．研究Bex2對(duì)U251及U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的基因治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：1．收集臨床神經(jīng)膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本，通過(guò)RT-PCR及Western blot( WB)分別檢測(cè)Bex2核酸及蛋白的表達(dá)水平，分析Bex2與人腦膠質(zhì)瘤的相關(guān)性；2．構(gòu)建pEGFP-Nl-Bex2真核表達(dá)載體，用WB及免

2、疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)檢測(cè)其在U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)效果；CCK-8檢測(cè)過(guò)表達(dá)Bex2對(duì)細(xì)胞增殖的影響；3．設(shè)計(jì)針對(duì)人Bex2基因特異性的三條siRNA oligo，并通過(guò)RT-PCR及WB檢測(cè)其在U251和U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的干擾效果；CCK-8檢測(cè)下調(diào)Bex2表達(dá)后12h，24h，48h，72h，96h各時(shí)間點(diǎn)U251及U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖變化；4．AnnexinV／PI染色后用流式細(xì)胞術(shù)及Hoechst33258染

3、色檢測(cè)下調(diào)Bex2表達(dá)后U251、U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡變化；WB檢測(cè)下調(diào)Bex2表達(dá)后c1eaved caspase-3、cleaved caspase-9的水平；5．在干擾Bex2同時(shí)用或不用JNK特異性抑制劑SP600125處理細(xì)胞，WB檢測(cè)p-JNK、p-c-Jun的水平；流式細(xì)胞術(shù)分析U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡情況。
　　 結(jié)果：1．在人腦膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本中Bex2表達(dá)明顯高于非腫瘤腦組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.

4、05)；2．成功構(gòu)建pEGFP-N1-Bex2真核表達(dá)載體，過(guò)表達(dá)Bex2促進(jìn)細(xì)胞增殖；3．三條Bex2特異性siRNA oligo干擾效率均達(dá)70％～80％; CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果顯示：下調(diào)Bex2表達(dá)后48h，72h，96h各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖能力較陰性對(duì)照組明顯下降；4．流式細(xì)胞術(shù)及Hoechst33258染色結(jié)果顯示下調(diào)Bex2表達(dá)后48h細(xì)胞凋亡率明顯高于陰性對(duì)照組（P＜0.05）；下調(diào)Bex2表達(dá)后48hcleaved ca

5、spase-3、cleaved caspase-9水平升高。5．下調(diào)Bex2表達(dá)后48h p-JNK、p-c-Jun升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); JNK特異性抑制劑SP600125處理可陽(yáng)斷下調(diào)Bex2表達(dá)對(duì)JNK/c-Jun的激活作用，也取消了下調(diào)Bex2對(duì)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。
　　 結(jié)論：1．Bex2在膠質(zhì)瘤組織中較非腫瘤腦組織高表達(dá)，提示Bex2可能參與了膠質(zhì)瘤發(fā)生；2．Bex2促進(jìn)U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖