Hermap基因?qū)t細(xì)胞分化發(fā)育過程中細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　 本課題組的前期研究顯示：①hermap基因高度特異地表達(dá)于K562、HEL細(xì)胞系，以及胎兒肝臟和骨髓、成人骨髓等造血組織；②在阿糖胞苷誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅細(xì)胞系方向分化的過程中，hermap基因的表達(dá)量逐漸增加，而在十二氟波酯鈉鹽誘導(dǎo)K562細(xì)胞向巨噬系方向分化的過程中，hermap基因的表達(dá)量卻無變化；③以含hermap－siRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后，可抑制AraC誘導(dǎo) K562細(xì)胞向紅系的分化，在此過

2、程中，hermap基因的表達(dá)量下降；④在SCF、IL-3和EPO體外誘導(dǎo)臍血MNCs向紅細(xì)胞系增殖分化的過程中，hermap基因的表達(dá)量逐漸升高，其趨勢(shì)與紅細(xì)胞分化發(fā)育過程一致；⑤采用Northern Blot方法研究顯示，hermap基因在25周胎兒肝臟和骨髓中表達(dá)陽性，而在胎兒脾臟、腎臟、胸腺、心臟、肺臟、大腦及肌肉中表達(dá)陰性。進(jìn)一步以FQ-PCR方法研究顯示，hermap基因在胎兒肝臟中表達(dá)是從第12周開始升高，18～20周達(dá)高峰

3、，21周后開始下降并穩(wěn)定于較低水平，與胚胎肝臟造血過程基本一致。Hermap在胎兒骨髓中的表達(dá)則從15周開始，27～32周達(dá)高峰，之后迅速下降，其表達(dá)規(guī)律與胎兒期骨髓造血過程基本一致。但妊娠32周后骨髓造血活動(dòng)仍然存在，而hermap基因的表達(dá)量卻迅速下降。
　　 課題的提出：hermap基因參與紅細(xì)胞增殖分化過程中的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)？hermap基因編碼紅細(xì)胞跨膜蛋白，屬免疫球蛋白超家族成員，高度特異地表達(dá)于K562細(xì)胞和HEL細(xì)

4、胞系以及胎兒肝臟和骨髓、成人骨髓等造血組織。根據(jù)其基因表達(dá)譜研究結(jié)果，推測(cè)hermap基因的功能可能與紅細(xì)胞系增殖分化有關(guān)，在胚胎發(fā)育過程中，可能還參與了紅系細(xì)胞向肝臟和骨髓的遷移活動(dòng)。通過對(duì)其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域與其它已知蛋白結(jié)構(gòu)域的比較，推測(cè)hermap基因在紅細(xì)胞系增殖分化過程中，可能參與了細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。但是，對(duì)于hermap確切的功能及其作用機(jī)理，尚未明了?；谏鲜?，本課題擬建立上調(diào)及下調(diào)hermap基因表達(dá)的K562細(xì)胞系，并以A

5、ra-C誘導(dǎo)其向紅細(xì)胞分化發(fā)育，在此過程中，觀察hermap基因?qū)t細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，以期找出HERMAP和紅細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的聯(lián)系。以期為探討hermap基因在紅細(xì)胞增殖分化過程中的作用，揭示其與紅細(xì)胞疾病的關(guān)系，并為發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控紅細(xì)胞分化發(fā)育的信號(hào)分子，提供新的依據(jù)和思路。
　　 研究目的：
　　 通過分別建立pEGFP-C1-hermap及pRNATH1.1-GFP/Neo-hermap siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)

6、染的K562細(xì)胞系，觀察上調(diào)及下調(diào)hermap基因的表達(dá)對(duì)AraC誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅細(xì)胞系分化過程中細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，探討hermap基因在紅細(xì)胞分化發(fā)育過程中的作用。
　　 研究方法：
　　 1.pEGFP-C1-hermap及pRNATH1.1-GFP/Neo-hermap siRNA的構(gòu)建1.1 pEGFP-C1-hermap的構(gòu)建設(shè)計(jì)分別帶有BamHI和EcoRV酶切位點(diǎn)的上下游引物，利用RT-PCR從K

7、562細(xì)胞cDNA中擴(kuò)增hermap的編碼序列，擴(kuò)增片斷大小為1428bp。Hermap編碼序列插入到帶有BglII和SmaI酶切位點(diǎn)的pEGFP-C1載體，所構(gòu)建的載體通過酶切及測(cè)序鑒定。
　　 1.2 pRNATH1.1-GFP/Neo-hermap siRNA的構(gòu)建針對(duì)靶基因hermap進(jìn)行設(shè)計(jì)，從中篩選出1對(duì)靶向hermap的siRNA序列，體外合成用于淬火的雙鏈DNA分子兩端各帶有BamHI和HindⅢ酶切位點(diǎn)，與帶有

8、相同酶切位點(diǎn)的載體pRNAT-H1.1-GFP連接。所構(gòu)建的載體通過酶切及測(cè)序鑒定。
　　 2．pEGFP-C1-hermap和pRNATH1.1-GFP/Neo-hermap siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞的篩選采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法分別將重組pEGFP-C1-hermap質(zhì)粒及hermap-siRNA-pRNAT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入K562細(xì)胞，經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)hermap和hermap-siRNA的兩個(gè)K562細(xì)胞系。
　　

9、 3．AraC誘導(dǎo)hermap/K562細(xì)胞和hermap-siRNA/K562細(xì)胞向紅細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)分為hermap組、hermap-siRNA組、空質(zhì)粒組及空白組，加入Ara-C后，于0h、24h、48h、72h和96h檢測(cè)hermap基因的表達(dá)量，同時(shí)，分別觀察細(xì)胞形態(tài)、聯(lián)苯胺染色陽性率、細(xì)胞表面標(biāo)記、A、G 珠蛋白基因的表達(dá)量，以證實(shí)其是否向紅系分化。
　　 4．上調(diào)及下調(diào)hermap基因的表達(dá)對(duì)紅細(xì)胞分化發(fā)育過程中細(xì)胞信

10、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響在Ara-C誘導(dǎo)上述K562細(xì)胞向紅系細(xì)胞分化的過程中，分別于0h、24h、48h、72h、96h檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵磷酸化激酶p-STAT5、p-Akt、p-MAPK、p-c-Jun等的變化，并分析其與hermap基因表達(dá)量的關(guān)系。
　　 研究結(jié)果：
　　 1．構(gòu)建了hermap-pEGFP及hermap-siRNA-pRNAT的真核表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果顯示hermap-pEGFP及hermap-si

11、RNA-pRNAT真核表達(dá)質(zhì)粒所攜帶的目的基因長(zhǎng)度分別為1428bp和55bp，其序列與hermap及設(shè)計(jì)的hermap-siRNA序列一致。
　　 2．建立了穩(wěn)定表達(dá)hermap和hermap-siRNA的兩個(gè)K562細(xì)胞系采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法將hermap-pEGFP及hermap-siRNA-pRNAT的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入K562細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后，在熒光顯微鏡下可見綠色熒光，初步證明細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)hermap基因或herm

12、ap-siRNA。
　　 3．上調(diào)hermap基因的表達(dá)可促進(jìn)Ara-C誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化發(fā)育的過程，而下調(diào)hermap基因的表達(dá)則可遏制這一過程在Ara-C誘導(dǎo)過程中，K562細(xì)胞出現(xiàn)以下變化：①細(xì)胞形態(tài)：4組細(xì)胞的體積逐漸減小，核漿比例逐漸減小，胞漿染色從深藍(lán)色轉(zhuǎn)變成藍(lán)紫色或淺紅色，核染色質(zhì)逐漸濃集、皺縮。提示K562細(xì)胞逐漸向早、中、晚幼紅細(xì)胞分化；②聯(lián)苯胺染色陽性率：hermap組在Ara-C誘導(dǎo)后24h、48h

13、、72h和96h，細(xì)胞聯(lián)苯胺染色陽性率逐漸增加，在上述各個(gè)時(shí)點(diǎn)均高于其他各組；hermap-siRNA組在誘導(dǎo)24h，細(xì)胞聯(lián)苯胺染色陽性率無明顯變化，48h、72h、96h后，細(xì)胞聯(lián)苯胺染色陽性率逐漸增加，在上述各時(shí)點(diǎn)均低于其他各組；③CD235a+/CD36-、CD235a+/CD36+和CD235a-/CD36+細(xì)胞比例：在Ara-C誘導(dǎo)后24h、48h、72h和96h，4組上述標(biāo)記陽性的細(xì)胞比例均逐漸增加，在上述各時(shí)點(diǎn)，herma

14、p組最高，而hermap-siRNA組最低；④A、G 珠蛋白基因表達(dá)量：hermap組在Ara-C誘導(dǎo)后24h、48h、72h和96h，Aγ基因的表達(dá)量逐漸增加，且在上述各個(gè)時(shí)點(diǎn)均高于其他各組；誘導(dǎo)后24h，Gγ基因的表達(dá)量無明顯變化，48h、72h、96h后，其表達(dá)量逐漸增加；hermap-siRNA組在Ara-C誘導(dǎo)后24h，Aγ基因的表達(dá)量無明顯變化，48h、72h和96h表達(dá)量逐漸增加，48h、96h均低于其余3組；隨著培養(yǎng)時(shí)間

15、的延長(zhǎng)，Gγ珠蛋白基因的表達(dá)量增加。
　　 4．上調(diào)或下調(diào)hermap基因的表達(dá)可引起磷酸化激酶p-STAT5、p-c-Jun的變化隨著Ara-C誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，4組p-STAT5陽性細(xì)胞的比例均逐漸增加，hermap組p-STAT5陽性細(xì)胞比例與hermap基因的增加具有正相關(guān)性，其余3組均與hermap的變化無相關(guān)性；hermap組p-c-Jun陽性細(xì)胞比例也逐漸增加，與hermap基因的增加呈正相關(guān)；hermap-siRN

16、A組p-c-Jun陽性細(xì)胞比例24h達(dá)最高，其后逐漸下降，在培養(yǎng)的各個(gè)時(shí)點(diǎn)高于其余3組，且與hermap基因表達(dá)量具有負(fù)相關(guān)性；4組p-MAPK陽性細(xì)胞、p-Akt陽性細(xì)胞比例與hermap基因的表達(dá)量無相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 1．本研究構(gòu)建了hermap-pEGFP及hermap-siRNA-pRNAT的真核表達(dá)載體。
　　 2．建立了穩(wěn)定表達(dá)hermap和hermap-siRNA的兩個(gè)K562細(xì)胞系，并

17、證實(shí)這兩種細(xì)胞系可分別穩(wěn)定表達(dá)hermap和hermap-siRNA，為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 3．上調(diào)hermap基因可促進(jìn)Ara-C誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化發(fā)育的過程，而下調(diào)hermap基因則可遏制該過程，進(jìn)一步提示hermap與紅系分化發(fā)育密切相關(guān)。
　　 4．ERMAP對(duì)紅細(xì)胞分化發(fā)育的影響可能是通過JAK/STAT5通路實(shí)現(xiàn)的。
　　 然而，在紅細(xì)胞分化發(fā)育過程的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，與ERMAP