MiR-221在前列腺癌雄激素非依賴(lài)轉(zhuǎn)變過(guò)程中作用的研究.pdf

1、前列腺癌(Prostate cancer，PCa)在許多西方國(guó)家是男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，占男性癌癥死因的第二位。在我國(guó)，近年來(lái)隨著生活水平的提高及人均壽命的延長(zhǎng)，前列腺癌發(fā)病率也呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)。自1941年Huggins等采用雄激素剝奪療法治療晚期前列腺癌取得顯著療效后，激素治療逐漸成為治療前列腺癌的一項(xiàng)重要的方法。這種方法早期一般是有效的，此時(shí)稱(chēng)激素敏感型前列腺癌(androgen-dependent ostate cancer

2、，ADPC)，其有效率一般可達(dá)70％左右，然而，經(jīng)過(guò)12～16個(gè)月病情緩解期后，幾乎無(wú)一例外的會(huì)進(jìn)展為激素非敏感的前列腺癌(androgen-independent prostate cancer，AIPC)，此期患者病情不可遏制的急劇惡化，腫瘤迅速轉(zhuǎn)移侵襲其它器官，最終因此導(dǎo)致患者死亡。治療失敗的原因是缺乏對(duì)于激素非依賴(lài)型前列腺癌的有效治療方法，此外，也因?yàn)槿狈?jiǎn)便準(zhǔn)確的早期前列腺腫瘤分期判定手段，醫(yī)生只有在多次穿刺，結(jié)合ADT治療行

3、進(jìn)過(guò)程中PSA觀察，定奪治療方案，這樣不僅增加了患者痛苦，也容易導(dǎo)致患者錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)期。因此，探索敏感、特異、準(zhǔn)確的前列腺癌分子標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期珍斷，以及尋找遏制前列腺癌進(jìn)入激素非依賴(lài)期的藥物，成為泌尿外科研究迫切需要解決的問(wèn)題。
　　 以往利用基因芯片和蛋白組學(xué)等方法，科研工作者對(duì)AIPC機(jī)制已經(jīng)開(kāi)展大量研究，極大推動(dòng)了對(duì)AIPC機(jī)制的了解。例如發(fā)現(xiàn)對(duì)前列腺癌具有代表性的分子除了PSA，還包括OC，PSMA，PAP，P

4、SMA，這些分子都是治療前列腺癌治療潛在的靶標(biāo)，但是深入研究表明，雖然這些分子聯(lián)合PSA檢測(cè)，提高了PCa的分期診斷，特異性和敏感性卻始終不能突破PSA對(duì)Pca的意義，對(duì)于AIPC的珍治始終缺乏有力的突破。
　　 近年來(lái)microRNA(miRNA)在腫瘤發(fā)生發(fā)展及耐藥性中發(fā)揮重要調(diào)控作用相應(yīng)得以證實(shí)，部分miRNA在相應(yīng)腫瘤中作用甚至申請(qǐng)國(guó)際專(zhuān)利保護(hù)，其對(duì)腫瘤的重要性迅速引起研究者興趣。通過(guò)計(jì)算機(jī)分析，人類(lèi)約30％的編碼蛋白基

5、因被miRNA所調(diào)控，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人類(lèi)miRNA大部分(52％)都位于已知的腫瘤相關(guān)基因組區(qū)域內(nèi)或已知的基因脆性位點(diǎn)，改變特異性miRNA的表達(dá)導(dǎo)致象腫瘤樣疾病的觸發(fā)和進(jìn)展。逐漸明確的miRNA表達(dá)譜研究使其迅速成為新的臨床輔助手段：1、miRNA表達(dá)譜為診斷工具。不明原發(fā)部位的轉(zhuǎn)移性癌是癌癥診斷中常見(jiàn)的一種情況。2、miRNA表達(dá)譜做為預(yù)后工具。值得關(guān)注是，miRNA表達(dá)的變化，尤其對(duì)低分化的腫瘤具有重要指導(dǎo)意義，而前列腺癌正屬于低分化

6、腫瘤的范疇，提示miRNA檢測(cè)可能為前列腺癌AIPC研究提供了新的突破口。這引起了眾多前列腺癌科研工作者的關(guān)注，miRNA針對(duì)PCa表達(dá)譜以及前列腺良性增生的表達(dá)譜近年累計(jì)有更新報(bào)道，雖然如此，針對(duì)PIN發(fā)展成癌變以及針對(duì)ASPC進(jìn)展為AIPC其中具有重要調(diào)控作用的miRNA，實(shí)驗(yàn)性研究才剛剛起步。
　　 本研究獲得AIPC5例標(biāo)本，和ADPC5例標(biāo)本一同送往通過(guò)國(guó)際認(rèn)證的miRNA芯片公司，在原位組織篩選獲得珍貴的miRNA差

7、異信息。并后期Nothern驗(yàn)證，確證miRNA-221表達(dá)差異顯著。而我們的結(jié)果提示，miR-221可能在晚期前列腺癌的雄激素治療非依賴(lài)化進(jìn)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，其具體作用機(jī)制和表達(dá)量可能跟前列腺癌細(xì)胞命運(yùn)甚至疾病進(jìn)程密切相關(guān)，為了進(jìn)一步明確miR-221對(duì)AIPC發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)意義，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)功能學(xué)檢測(cè)。以求尋找理想的診治晚期前列腺癌的有效靶標(biāo)。
　　 目的:
　　 針對(duì)激素治療敏感和失效的病例標(biāo)本，進(jìn)行miRNA

8、芯片篩選，建立前列腺癌雄激素阻斷治療后，兩個(gè)重要階段的miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)細(xì)胞模型，明確miR-221主要參與調(diào)控細(xì)胞哪些生物學(xué)功能。尋找miR-221作用的靶蛋白，探索miR-221作用機(jī)制。探測(cè)分析miR-221及其調(diào)控的靶蛋白與雄激素非依賴(lài)前列腺癌產(chǎn)生及進(jìn)展的關(guān)系。
　　 本研究利用激素依賴(lài)的LNCaP前列腺癌細(xì)胞系在體外誘導(dǎo)下建立激素非依賴(lài)LNCaP前列腺癌細(xì)胞亞系，模擬前列腺癌在激素剝奪治療后由激素依賴(lài)性向非依

9、賴(lài)性轉(zhuǎn)變的過(guò)程，對(duì)其發(fā)生機(jī)制進(jìn)行初步探討，并為進(jìn)一步深入研究激素非依賴(lài)前列腺癌的發(fā)生機(jī)理，提供一個(gè)可靠的平臺(tái)。通過(guò)對(duì)比LNCaP-AI(雄激素非依賴(lài)細(xì)胞)與LNCaP細(xì)胞中microRNA的變化，進(jìn)一步闡述非雄轉(zhuǎn)化的機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、針對(duì)ADPC和AIPC的病人組織標(biāo)本各5例，篩選差異miRNA，鑒定miRNA表達(dá)差異通過(guò)Northen和RT-PCR方法，鑒定組織樣本中miRNA芯片篩選的miRNA表達(dá)存在

10、差異并探測(cè)差異大小，明確后續(xù)工作有研究?jī)r(jià)值。
　　 2、建立雄激素非依賴(lài)細(xì)胞模型，根據(jù)組織學(xué)篩選的miRNA表達(dá)譜，鑒定并比較差異miRNA在LNCaP/AI-LNCaP細(xì)胞模型和ASPC/AIPC組織表達(dá)是否平行，明確細(xì)胞模型可以用于生物學(xué)功能研究，選取表達(dá)差異大的miRNA(miR-221)進(jìn)行生物學(xué)功能探索。
　　 3、建立前列腺癌細(xì)胞侵襲模型，使用細(xì)胞轉(zhuǎn)染探測(cè)分析雄激素對(duì)miR-221細(xì)胞定位及細(xì)胞生物學(xué)功能的影

11、響，深入探討miR-221在激素非依賴(lài)化轉(zhuǎn)變中的作用機(jī)制。
　　 4、通過(guò)生物信息學(xué)和miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選miR-221作用的靶蛋白基因，確定靶基因確切結(jié)合區(qū)域或位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)western blot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步明確miR-221及其調(diào)控的靶基因與疾病的關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 1、利用Northern及RT-PCR方法檢測(cè)，ADPC及AIPC患者標(biāo)本中差異表達(dá)的microRNA，其中表達(dá)下調(diào)的有m

12、iR-15a和miR-101，上調(diào)有miR-221，miR-222 miR-21，miR-205和miR-125b，其中miR-221上調(diào)明顯。
　　 2、利用RT-PCR檢測(cè)LNCaP-AI，LNCaP細(xì)胞系中miR-221的表達(dá)明顯升高，達(dá)10倍左右。證明miR-221在前列腺癌的雄激素非依賴(lài)轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮作用。
　　 3、CCK-8方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染了miR-221的LNCaP及LNCaP-AI細(xì)胞能夠在無(wú)激素的環(huán)境下迅

13、速增殖，并且轉(zhuǎn)染了anti-miR-221的LNCaP及LNCaP-AI細(xì)胞生長(zhǎng)則明顯受到抑制。通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了miR-221的LNCaP及LNCaP-AI細(xì)胞的S期細(xì)胞明顯升高，證明miR-221有可能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)。
　　 4、通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-221至LNCaP細(xì)胞發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染3天后LNCaP細(xì)胞出現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌型表現(xiàn)，RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染了miR-221的LNCaP細(xì)胞中NSE的水平較對(duì)照組明顯升高，We

14、stern在蛋白水平檢測(cè)NSE蛋白也明顯高表達(dá)。提示miR-221促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)化。
　　 5、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染了miR-221的LNCaP-AI細(xì)胞遷移至空白區(qū)的細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯增加，證實(shí)其遷移能力明顯增強(qiáng)。
　　 6、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了anti-miR-221的LNCaP-AI細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯升高，提示miR-221提高了LNCaP-AI細(xì)胞的侵襲能力。

15、>　　 7、通過(guò)檢索microrna.sanger.ac.uk針對(duì)miR-221尋找相關(guān)調(diào)控的靶基因DVL2，提示mi R-221通過(guò)調(diào)控DVL2從而影響前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力。qRT-PCR方法對(duì)比LNCaP-AI與LNCaP細(xì)胞中DVL2明顯上調(diào)。通過(guò)Western檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了miR-221的LNCaP-AI細(xì)胞中DVL2相對(duì)于對(duì)照組明顯升高。提示miR-221通過(guò)調(diào)節(jié)DVL2從而改變LNCaP-AI的侵襲能力。
　　

16、8、通過(guò)收集ADPC及AIPC期患者的全血，利用RT-PCR檢測(cè)miR-221的水平，發(fā)現(xiàn)AIPC患者中miR-221的水平明顯低于ADPC患者?？梢杂脕?lái)進(jìn)行作為前列腺癌患者進(jìn)展的指標(biāo)。
　　 結(jié)論:
　　 1、本研究通過(guò)對(duì)于miR-221在不同前列腺癌細(xì)胞系中的功能的研究，發(fā)現(xiàn)miR-221通過(guò)增加S期細(xì)胞的數(shù)量，從而促進(jìn)LNCaP及LNCaP-AI細(xì)胞的增殖。因此miR-221會(huì)在前列腺癌的生長(zhǎng)及進(jìn)展期發(fā)揮作用。同時(shí)

17、我們也證實(shí)miR-221通過(guò)增加NSE的表達(dá)促進(jìn)LNCaP細(xì)胞的神經(jīng)內(nèi)分泌化的轉(zhuǎn)變。而NE的轉(zhuǎn)變則被認(rèn)為是前列腺癌雄激素非依賴(lài)性轉(zhuǎn)變的重要原因。
　　 2、通過(guò)對(duì)于LNCaP及LNCaP-AI細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同miR-221模擬物進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-221可以明顯提升LNCaP-AI細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這也在一定程度上證明miR-221可以促進(jìn)晚期前列腺癌的擴(kuò)散。并且通過(guò)對(duì)于其靶基因的尋找發(fā)現(xiàn)DVL2可能是改變LNCaP-AI細(xì)胞