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文檔簡(jiǎn)介
1、前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)是男性患者中最常見(jiàn)的因?qū)嵭云鞴賽盒阅[瘤和癌癥而致死亡的第二個(gè)主要原因。根據(jù)長(zhǎng)期大量的流行病學(xué)等研究,前列腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展主要受雄激素以及飲食習(xí)慣等綜合因素的影響。而長(zhǎng)期慢性炎癥的刺激會(huì)導(dǎo)致人類罹患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)大大增加,患癌的風(fēng)險(xiǎn)比正常人增加約20%,這其中包括胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和肺癌。流行病學(xué)研究和組織病理學(xué)證據(jù)表明,PCa的發(fā)生率也與炎癥相關(guān),但是其具體的機(jī)制,至目前仍不完全被人類所
2、認(rèn)知?;旧希陕匝装Y最先創(chuàng)建一個(gè)環(huán)境,豐富的炎癥反應(yīng)可能會(huì)導(dǎo)致不受控制的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子增殖反應(yīng)和快速分裂的基因突變的單元格。因此,PCa是與炎癥密切相關(guān)特別是與炎癥因子的作用。
白細(xì)胞介素是人類體內(nèi)廣泛存在的炎癥細(xì)胞因子,其種類繁多。而白細(xì)胞介素-6(IL-6)是一款多功能炎癥因子。研究表明,細(xì)胞因子的表達(dá)及功能改變與人類的所患惡性腫瘤息息相關(guān)。白細(xì)胞介素-6也已被認(rèn)定其在PCa患者的臨床標(biāo)本中表達(dá)和Pca細(xì)胞株中廣泛
3、存在。
G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)48,也被稱為富含亮氨酸重復(fù)包含GPCR(LGR)4,其是一種糖蛋白激素受體,屬于GPCR家族,并在其GPCR家族中扮演重要角色。一般情況下,LGR4將編碼GPCR偶聯(lián)蛋白之一。一項(xiàng)最近的研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-6增強(qiáng)LGR4蛋白在骨肉瘤細(xì)胞的表達(dá),表明LGR4可能影響白細(xì)胞介素-6基因在腫瘤表達(dá)。此外,臨床前和臨床研究已經(jīng)證實(shí),GPCR在PCa組織組織中高表達(dá)。
LGR4的表達(dá)與多種類
4、型的癌癥的發(fā)生相關(guān),包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌和胃癌,以及肝癌的形成。LGR4對(duì)腫瘤的影響已認(rèn)識(shí)到,但目前卻對(duì)LGR4表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚不清楚。
小分子RNA(miRNA)是一套內(nèi)源性小非編碼RNA(19-22堿基的長(zhǎng)度)。和調(diào)節(jié)基因翻譯、表達(dá)或裂解以及RNA序列的特異性相關(guān)。大量證據(jù)表明,miRNA調(diào)節(jié)不同生物過(guò)程,包括細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和細(xì)胞凋亡。miRNA下調(diào)多個(gè)靶基因,包括原癌基因和抑癌基因,同時(shí)一些miRNA功能
5、作為腫瘤抑制因子和其他基因一起充當(dāng)原癌基因。特別是,miR-218,在有關(guān)miRNA抑制腫瘤發(fā)展的研究中,其已被廣泛認(rèn)為與研究的幾種類型癌癥高度相關(guān),在前列腺癌中同樣存在。在本研究中,我們即是想探討LGR4作為miR-218的下位靶點(diǎn),其是如何通過(guò)調(diào)控LGR4影響PCa細(xì)胞增殖和侵襲的。
目的:
?。ㄒ唬┓謩e采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和ELISA法檢測(cè)miR-218和IL-6在癌旁正常組織(NP)、良性前列腺增生組(BP
6、H)、前列腺癌組織的表達(dá)水平。
?。ǘ┙⒘艘粋€(gè)在IL-6低濃度下長(zhǎng)期孵育的LNCaP-IL-6細(xì)胞亞系,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-218在LNCaP和LNCaP-IL-6細(xì)胞傳代過(guò)程中的表達(dá)水平趨勢(shì)。采用BrdU和Transwell法對(duì)IL-6和miR-218在LNCaP-IL-6細(xì)胞系的影響進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
?。ㄈ┎捎肳estern blot analysis法檢測(cè)IL-6和miR-218在LNCaP-I
7、L-6+細(xì)胞中對(duì)于LGR4蛋白表達(dá)的影響。
方法:
1.1病例選擇:選取2012年7月至2015年7月在我院診治的經(jīng)確診的58例前列腺癌患者的癌組織標(biāo)本(Pca)、51例前列腺癌患者的癌旁正常組織標(biāo)本(NP)、以及56例良性前列腺增生(BPH)患者的前列腺組織,同時(shí)均保存在-80℃冰箱內(nèi)。所有患者均經(jīng)入組標(biāo)準(zhǔn)篩選為確診病例。
1.2排除標(biāo)準(zhǔn):已經(jīng)接受了內(nèi)分泌或其他治療的患者被排除。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
8、:分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和ELISA法檢測(cè)miR-218和 IL-6在癌旁正常組織(NP)、良性前列腺增生組(BPH)、前列腺癌組織(Pca)的表達(dá)水平;建立了一個(gè)在IL-6低濃度下長(zhǎng)期孵育的LNCaP-IL-6細(xì)胞亞系,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-218在LNCaP和LNCaP-IL-6細(xì)胞傳代過(guò)程中的表達(dá)水平趨勢(shì);采用BrdU和Transwell法對(duì)IL-6和miR-218在LNCaP-IL-6細(xì)胞系的影響進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析
9、;采用Western blot analysis檢測(cè)IL-6和miR-218在LNCaP-IL-6細(xì)胞中對(duì)于LGR4蛋白表達(dá)的影響。
1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:定量資料采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,測(cè)定結(jié)果以x±s表示,對(duì)RT-PCR各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,以P<0.05差異為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果:
?。ㄒ唬﹎iR-218和IL-6在各組織中的表達(dá)水平
1.miR-218在癌旁正常組織(N
10、P)、良性前列腺增殖組織(BPH)、前列腺癌組織(Pca)的表達(dá)水平依次降低,分別為(1.49±0.07)、(0.89±0.02)、(0.51±0.02),差異顯著(P=0.012)、(P=0.024)、((P=0.001)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.IL-6在癌旁正常組織(NP)、良性前列腺增殖組織(BPH)、前列腺癌組織(Pca)的水平依次升高,分別為(1.09±0.05)、(1.89±0.01)、(2.52±0.02),差異顯
11、著(P=0.002)、(P=0.004)、((P=0.020)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
?。ǘ┰贚NCaP-IL-6細(xì)胞亞系中,長(zhǎng)期IL-6的刺激后,LNCaP細(xì)胞中miR-218表達(dá)水平下降,結(jié)果說(shuō)明miR-218的表達(dá)在LNCaP轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)NCaP-IL-6+細(xì)胞的過(guò)程中逐漸下降。
?。ㄈ﹎iR-218阻礙IL-6誘導(dǎo)的LNCaP-IL-6細(xì)胞的增殖和侵襲。BrdU分析結(jié)果表明IL-6促進(jìn)LNCaP-IL-6細(xì)胞增殖,然而
12、miR-218轉(zhuǎn)染抑制了該作用。并且IL-6導(dǎo)致細(xì)胞周期中G0/G1期的細(xì)胞比例減少,相反mi-R218轉(zhuǎn)染促進(jìn)G0/G1期數(shù)目細(xì)胞的增加。Transwell的結(jié)果顯示,LNCaP-IL-6細(xì)胞的侵襲能力在使用IL-6后顯著升高,然而這一作用被miR-218的轉(zhuǎn)染顯著抑制。
?。ㄋ模¦estern blot analysis法檢測(cè)分別受到IL-6和miR-218影響的LNCaP-IL-6+細(xì)胞中LGR4蛋白表達(dá)水平:LGR4在I
13、L-6誘導(dǎo)的LNCaP-IL-6細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量為(2.20±0.30); LGR4在miR-218誘導(dǎo)的LNCaP-IL-6細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量為(0.40±0.01); LGR4在IL-6+miR-218誘導(dǎo)的LNCaP-IL-6細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)量為(1.30±0.21);三者之間比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
(五)RT-PCR法檢測(cè)miR-218在miR-218轉(zhuǎn)染后的LNCaP-IL-6+細(xì)胞系中的表達(dá)水平:在miR-218
14、轉(zhuǎn)染組miR-218的相對(duì)表達(dá)量為(1.20±0.20),與對(duì)照組相比顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
?。¦estern blot analysis法LGR4蛋白在miR-218轉(zhuǎn)染后的LNCaP-IL-6+細(xì)胞系中的表達(dá)水平:在miR-218轉(zhuǎn)染組LGR4蛋白的相對(duì)表達(dá)量為(0.30±0.03),與對(duì)照組相比顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)論:
?。ㄒ唬┰谇傲邢侔┑牟〕讨衜iR-218的表達(dá)下調(diào),IL-
15、6的表達(dá)上調(diào)。熒光定量PCR結(jié)果示:BPH患者miR-218的表達(dá)較正常前列腺偏低,在前列腺癌患者的表達(dá)較BPH患者偏低。然而,ELISA結(jié)果顯示IL-6水平在正常、BPH、前列腺癌患者中趨勢(shì)與上述相反。長(zhǎng)期IL-6的刺激后,LNCaP細(xì)胞中miR-218表達(dá)水平下降,結(jié)果說(shuō)明miR-218的表達(dá)在正常前列腺、BPH、前列腺癌的進(jìn)程中和LNCaP轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)NCaP-IL-6細(xì)胞的過(guò)程中逐漸下降,而IL-6逐漸升高。
?。ǘ㎝iR
16、-218阻礙IL-6誘導(dǎo)的LNCaP-IL-6細(xì)胞的增殖和侵襲。BrdU分析結(jié)果表明IL-6促進(jìn)LNCaP-IL-6細(xì)胞增殖,然而miR-218轉(zhuǎn)染抑制了該作用。統(tǒng)計(jì)分析表明IL-6導(dǎo)致細(xì)胞周期中G0/G1期的細(xì)胞比例減少,相反mi-R218轉(zhuǎn)染促進(jìn)G0/G1期數(shù)目細(xì)胞的增加,LNCaP-IL-6細(xì)胞的侵襲能力在使用IL-6后顯著升高,然而這一作用被miR-218的轉(zhuǎn)染顯著抑制。
(三)MiR-218抑制IL-6誘導(dǎo)的LNCa
17、P-IL-6細(xì)胞中LGR4的表達(dá)。結(jié)果顯示LGR4在LNCaP-IL-6細(xì)胞中經(jīng)IL-6預(yù)處理后顯著增加,然而miR-218準(zhǔn)然后完全抑制了以上變化
?。ㄋ模㎝iR-218通過(guò)結(jié)合在LGR43'-UTR靶點(diǎn)發(fā)揮作用。生物信息預(yù)測(cè)顯示在miR-218和LGR4的3'-UTR之間存在一個(gè)可能的結(jié)合位點(diǎn)。為了證實(shí)這個(gè)靶點(diǎn),我們進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因分析,去評(píng)估被MIR-LGR4-UTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞的螢光素酶活性,并與轉(zhuǎn)
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