前列腺癌細(xì)胞LNCaP激素非依賴性轉(zhuǎn)變過程中microRNA的變化研究.pdf

1、一、研究背景 自1941年Huggins等采用雄激素剝奪療法治療晚期前列腺癌取得顯著療效后,激素治療逐漸成為治療前列腺癌的一項重要的方法。但隨著激素治療在前列腺癌治療中的廣泛應(yīng)用,人們發(fā)現(xiàn)雄激素剝奪療法的效果平均只有12～16個月,此后前列腺癌繼續(xù)生長、惡化,一年生存率僅為50％,臨床上將這種情況稱為激素非依賴性前列腺癌。因此,激素非依賴性前列腺癌的研究成為泌尿外科學(xué)中一個重要課題。 目前對激素非依賴前列腺癌的研究熱點主

2、要集中在雄激素受體、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的調(diào)控、多肽生長因子、腫瘤血管形成和一些與激素非依賴密切相關(guān)的基因等多個方面。 雖然這些研究從不同的角度為激素非依賴前列腺癌的發(fā)生機制,提供了許多有價值的信息。但是,人們對前列腺癌從激素依賴向激素非依賴轉(zhuǎn)變過程的分子生物學(xué)改變?nèi)晕茨芡笍亓私?。主要的研究障礙就是缺乏理想的細(xì)胞模型,來模擬體內(nèi)前列腺癌患者由激素依賴向激素非依賴轉(zhuǎn)變的過程。最近的研究表明LNCaP細(xì)胞系能夠在激素剝奪的環(huán)境下逐漸轉(zhuǎn)

3、變?yōu)榧に胤且蕾嚨腖NCaP前列腺癌細(xì)胞亞系。這種前列腺癌細(xì)胞模型可以模擬臨床內(nèi)分泌治療過程中,前列腺癌由激素依賴發(fā)展為雄激素非依賴的過程。同時,由于是從LNCaP前列腺癌細(xì)胞系經(jīng)過干預(yù)建立的細(xì)胞亞系,兩者具有可比性,可以用來觀察前列腺癌由激素依賴向非依賴轉(zhuǎn)變過程的分子生物學(xué)變化,是一個理想的研究激素非依賴前列腺癌機制的模型。 近幾年隨著對microRNA(miRNA)重視,越來越多的與細(xì)胞分化成熟障礙、增殖失控、細(xì)胞永生化為本質(zhì)

4、的腫瘤疾病密切相關(guān)的miRNA被發(fā)現(xiàn),在組織和細(xì)胞不同的分化時相中,miRNA有著本身獨特的表達(dá)方式,即不同時相有不同的表達(dá)。目前認(rèn)為,miRNA在腫瘤發(fā)生中的作用主要在于3個方面：①有些編碼miRNA的基因可能起著癌基因的作用；②有些miRNA基因則可能起到抑癌基因的作用；③一些致瘤病毒編碼的miRNA也可能參與相關(guān)腫瘤的發(fā)生。通過臨床研究發(fā)現(xiàn),某些特異性miRNA的變化能夠?qū)δ[瘤診斷及提示預(yù)后有幫助,甚至于與臨床分期分級有關(guān)。并且在

5、急性白血病中應(yīng)用mir-16和mir-15基因治療取得有意義的進(jìn)展,開拓了腫瘤治療的新紀(jì)元。提出重新使miRNA的表達(dá)平衡(把升高的miRNA降低、降低的予以升高)可能是腫瘤治療的一個方向。由于對前列腺癌研究microRNA的方法不同,可能有不同的結(jié)果,甚至相反。也由于對microRNA功能及機理還沒有完全了解,microRNA對靶基因的調(diào)控不是一對一的關(guān)系,而是一個microRNA可以調(diào)控多個靶基因,在不同的細(xì)胞條件,其功能可能變化等

6、復(fù)雜情況,還不能解釋其中的差異。對前列腺癌相關(guān)的microRNA還有大量沒有明確。系統(tǒng)、全面的研究其功能及表達(dá),從而利用microRNA來對腫瘤定性分級及尋找出治療靶點,是將來的一個新方向。盡管有初步研究提示一些microRNA與前列腺癌非雄依賴轉(zhuǎn)化有關(guān),但還有許多沒有系統(tǒng)的研究,及早明確哪些microRNA參入了非雄依賴轉(zhuǎn)化及其功能,是研究前列腺癌非雄依賴轉(zhuǎn)化的一個新起點?？梢韵嘈?microRNA將是腫瘤(包括前列腺癌)研究的新熱點

7、領(lǐng)域。 二、研究目的： 本研究利用激素依賴的LNCaP前列腺癌細(xì)胞系在體外誘導(dǎo)下建立激素非依賴LNCaP前列腺癌細(xì)胞亞系,模擬前列腺癌在激素剝奪治療后由激素依賴性向非依賴性轉(zhuǎn)變的過程,對其發(fā)生機制進(jìn)行初步探討,并為進(jìn)一步深入研究激素非依賴前列腺癌的發(fā)生機理,提供一個可靠的平臺。通過對比LNCaP-AI(雄激素非依賴細(xì)胞)與LNCaP細(xì)胞中microRNA的變化,進(jìn)一步闡述非雄轉(zhuǎn)化的機制。 三、主要研究內(nèi)容：

8、 1、體外長期在去激素的血清環(huán)境下培養(yǎng)LNCaP細(xì)胞,培養(yǎng)出能夠適應(yīng)無激素環(huán)境的LNCaP細(xì)胞亞系(LNCaP-AI細(xì)胞系)。 2、通過CCK-8方法驗證LNCaP-AI細(xì)胞系在無激素環(huán)境下的增殖能力；熒光免疫的方法檢測LNCaP-AI細(xì)胞系分泌PSA的情況。 3、RT-PCR的方法檢測LNCaP-AI細(xì)胞系A(chǔ)R基因表達(dá)情況,利用Agilent microRNA寡核苷酸基因芯片對LNCaP及LNCaP-AI細(xì)胞檢測mi

9、croRNA的變化,并用RT-PCR方法對6個microRNA進(jìn)行驗證,驗證過程中,對比利用PC-3細(xì)胞及PC-3細(xì)胞去雄一周7個microRNA的變化。 4、通過檢索已有的非雄依賴轉(zhuǎn)化過程中上調(diào)表達(dá)的基因,對比我們已測定的microRNA,聯(lián)系microrna.sanger.ac.uk針對靶基因?qū)ふ蚁嚓P(guān)調(diào)控的microRNA,來闡述microRNA的變化與已上調(diào)基因的關(guān)系,從而說明microRNA的變化參入前列腺癌激素非依賴轉(zhuǎn)

10、化。 5、半定量PCR法測定LNCaP及LNCaP-AI細(xì)胞促紅細(xì)胞生成素(EPO)及促紅細(xì)胞生成素受體(EPOR)的變化,來推斷EPO及EPOR是否參入非雄依賴轉(zhuǎn)化的過程。 6、利用P,E標(biāo)記c-kit抗體及流式細(xì)胞儀測定LNNCaP及LNCaP-AI細(xì)胞膜原癌受體c-kit的表達(dá)情況。 四、結(jié)果： 1、利用活性炭處理的血清培養(yǎng)模擬去雄細(xì)胞環(huán)境,逐步遞減培養(yǎng)基中激素10天,后完全在非雄培養(yǎng),共連續(xù)培養(yǎng)3

11、個月,一周左右開始處于自分泌狀態(tài),3個月后逐漸適應(yīng)了無激素的環(huán)境,能夠正常增殖,成為激素非依賴的LNFCaP-AI細(xì)胞亞系。 2、CCK-8方法檢測LNCaP-AI細(xì)胞能夠在無激素的環(huán)境下迅速增殖,LNCaP細(xì)胞生長則明顯受到抑制。熒光免疫法檢測在無激素的環(huán)境下LNCaP-AI細(xì)胞培養(yǎng)液中PSA的分泌水平能夠隨著時間的推移而逐漸增加,而LNCaP細(xì)胞的PSA的分泌則明顯受到抑制,始終處于極低的水平。RT-PCR法檢測LNCaP-

12、AI細(xì)胞表達(dá)AR的水平要明顯高于LNCaP細(xì)胞,表達(dá)水平是后者7倍。 3、通過LNCaP-AI細(xì)胞和LNCaP細(xì)胞Agilent microRNA芯片方法檢測發(fā)現(xiàn),LNCaP-AI細(xì)胞有37個microRNA降低,有11個microRNA升高。選出6個microRNA驗證結(jié)果與Agilent microRNA芯片檢測結(jié)果一致。通過PC-3細(xì)胞去雄一周對比前后6個microRNA的變化,提示5個變化與去雄處理相關(guān)。 4、通

13、過檢索microrna.sanger.ac.uk針對microRNA調(diào)控的靶基因,參考已發(fā)現(xiàn)與非雄依賴相關(guān)的基因,發(fā)現(xiàn)LNCAP轉(zhuǎn)化為激素非依賴的LNCAP-AI細(xì)胞中,明顯變化的microRNA主要調(diào)控AR、EGFR、MMP9、c-kit、bcl-2和雄激素相關(guān)代謝酶。認(rèn)為非雄依賴轉(zhuǎn)化過程中microRNA的變化,通過調(diào)高AR、AR旁路信號通路、金屬酶、抗凋亡基因及雄激素相關(guān)代謝酶基因的表達(dá),參入了前列腺癌非雄依賴轉(zhuǎn)化。 5、

14、半定量PCR法沒有發(fā)現(xiàn)LNCaP及LNCaP-AI EPO及EPOR有明顯的變化,說明EPO及EPOR可能沒有參入LNCaP非雄依賴轉(zhuǎn)化。 6、利用P,E標(biāo)記c-kit抗體及流式細(xì)胞儀測定LNCaP及LNCaP-AI細(xì)胞膜原癌受體c-kit的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)LNCaP-AI細(xì)胞膜原癌受體c-kit的表達(dá)高于LNCaP,認(rèn)為通過microRNA的變化,能夠調(diào)高c-kit的表達(dá),參入非雄依賴的轉(zhuǎn)化。 五、結(jié)論： 1、本

15、研究利用LNCaP前列腺癌細(xì)胞系,在去激素的培養(yǎng)液中長期培養(yǎng),培養(yǎng)出激素非依賴性的LNCaP-AI前列腺癌細(xì)胞亞系。這種前列腺癌細(xì)胞模型可以模擬臨床上在內(nèi)分泌治療過程中,前列腺癌由激素依賴發(fā)展為雄激素非依賴的過程。同時,由于是從LNCaP前列腺癌細(xì)胞系經(jīng)過干預(yù)建立的細(xì)胞亞系,兩者有可比性,可以用來觀察前列腺癌由激素依賴向非依賴轉(zhuǎn)變過程的分子生物學(xué)變化,是一個理想的激素非依賴前列腺癌的細(xì)胞模型。 2、通過LNCaP-AI細(xì)胞和LN

16、CaP細(xì)胞Agilent microRNA芯片方法檢測發(fā)現(xiàn),LNCaP-AI細(xì)胞有37個microRNA降低,有11個microRNA升高。通過檢索microrna.sanger.ac.uk針對microRNA調(diào)控的靶基因,參考已發(fā)現(xiàn)與非雄依賴相關(guān)的基因,發(fā)現(xiàn)LNCaP轉(zhuǎn)化為激素非依賴的LNCaP-AI細(xì)胞中,明顯變化的microRNA主要調(diào)控AR、EGFR、MMP9、c-kit、bcl-2和雄激素相關(guān)代謝酶。其中,AR、EGFR、bc

17、l-2、MMP9和雄激素相關(guān)代謝酶在非雄依賴轉(zhuǎn)化中都是高表達(dá)的。發(fā)現(xiàn)這些上調(diào)的基因相關(guān)的microRNA大部分是降低的,根據(jù)microRNA調(diào)控基因的原理,可以推測這些microRNA可能通過轉(zhuǎn)錄后抑制的降低,調(diào)高相關(guān)基因的表達(dá)。認(rèn)為非雄依賴轉(zhuǎn)化過程中microRNA的變化,通過調(diào)高AR、AR旁路信號通路、金屬酶、抗凋亡基因及雄激素相關(guān)代謝酶基因的表達(dá),參入了前列腺癌非雄依賴轉(zhuǎn)化。利用P,E標(biāo)記c-kit抗體及流式細(xì)胞儀測定LNCaP及